第一篇 生物技術制藥工藝*農業院校一般都是學《發酵工程》，食品上叫發酵罐，醫藥上叫生物反應器。其實都是差不多。這里的生物技術制

第一篇 生物技術制藥工藝

*農業院校一般都是學《發酵工程》，食品上叫發酵罐，醫藥上叫生物反應器。其實都是差不多。這里的生物技術制藥工藝缺少對”自動控制技術“的應用對生產工藝效率提升的認識，在日益減少人工的今天稍顯落后。

（工程技術只能叫專家，稱自己為科學家就有點可笑了，“千人”亦是如此。）

第一章　緒論

1.1 制藥工藝學

1.2 天然提取制藥技術發展

1.3 生物技術制藥發展

1.4 化學合成制藥技術發展

1.5 制藥工業的發展

1.6 制藥技術展望

第二章　微生物發酵制藥工藝

2.1 微生物發酵與制藥

2.2 制藥微生物生長與生產關系

2.3 制藥微生物菌種的建立

2.4 培養基制備

2.5 滅菌工藝

2.6 微生物發酵培養技術

2.7 發酵工藝過程的控制

2.8 抗生素生產工藝

2.9 氨基酸發酵生產工藝

2.10 維生素生產工藝 第三章 基因工程制藥工藝

3.1 基因工程制藥微生物表達系統

3.2 基因工程大腸桿菌的構建

3.3 基因工程菌的發酵培養與控制

3.4 重組人干擾素生產工藝

3.5 重組人生長素生產工藝

3.6 重組人胰島素生產工藝 第四章 動物細胞培養制藥工藝

4.1 制藥動物細胞

4.2 哺乳動物細胞生產特征

4.3 動物細胞培養基的制備

4.4 動物細胞的培養技術

4.5 動物細胞培養過程的檢測與工藝控制

4.6 重組人紅細胞生成素生產工藝

4.7 單克隆抗體生產工藝 第二篇 化學制藥工藝

第五章 工藝路線的設計和選擇

5.1 概述

5.2 工藝路線的設計

5.3 工藝路線選擇 第六章 合成工藝研究

6.1 概述

6.2 反應物的濃度和配料比

6.3 溶劑的選擇和溶劑化效應

6.4 反應溫度和壓力

6.5 藥品質量監控和工藝研究中的過渡試驗 第七章 典型化學制藥工藝

7.1 氯霉素的生產工藝

7.4 紫杉醇的生產工藝

7.2 頭孢氨芐的生產工藝 第三篇 制藥工藝共性基礎

第八章 制藥工藝計算

8.1 工藝設計圖

8.2 物料衡算

8.3 能量衡算

8.4 工藝經濟性評價 第九章 反應器設計

9.1 概述

9.2反應器的分類和結構特點

9.3 發酵罐設計與分析

9.5 其他反應器 第十章 中試放大

10.1 中試放大的概念與內容 （在食用菌工廠正好趕上中試）

10.2 中試放大研究的基本方法

10.3 中試放大的研究

1.1制藥工藝學

1.1 制藥工藝學

1.1.1 制藥工藝學的研究對象

制藥工藝學是研究藥物的工業生產過程共性規律及其應用，包括制備原理、工藝路線、質量控制。 現代制藥的特點是技術含量高、智力密集，發展方向是全封閉自動化、全程質量控制，大規模反應器生產和新型分離技術綜合利用。

制藥工藝學的工程性和實用性較強，加之藥品種類繁多，生產工藝流程多樣，過程復雜。即使進行仿制藥物的生產，也必須要有自主知識產權的工藝。制藥工藝作為把藥物產品化的一種技術過程，貫穿于藥物研發的整個過程，是現代醫藥行業的關鍵技術領域。制藥工藝是藥物產業化的橋梁與瓶頸，對工藝的研究是加速產業化的一個重要方面。因此，學習掌握制藥工藝學具有重要意義。

1.1.2 制藥工藝學的內容

制藥工藝學是綜合應用化學系列、生物系列、機械設備與工程單元操作等課程的專門知識，深化理解并掌握工藝原理，充分考慮藥品的特殊性，針對生產條件、所需環境等的具體要求，研究藥物制造原理、工藝路線與過程優化、中試放大、生產技術與質量控制，從而分析和解決生產過程的實際問題。從工業生產角度，改造、設計和開發藥物的生產工藝，制定相應的操作規程。

制藥工藝學與其他基礎課、專業課聯系密切，而且與生產實踐緊密相關。通過設計、研究藥物大規模生產的工藝條件與設備選型，從中選出最安全、最經濟、最可行的工藝路線。

1.1.3 制藥工藝的類別

可根據典型的藥物生產過程，把制藥工藝過程分為4類，生物技術制藥工藝學、化學制藥工藝學、中藥制藥工藝學和制劑工藝學。

1.1.3.1 生物技術制藥工藝

以生物體和生物反應過程為基礎，依賴于生物機體或細胞的生長繁殖及其代謝過程，利用工程學原理和方法對實驗室所取得的藥物研究成果進行開發放大，在反應器內進行生物反應合成，進而生產制造出商品化藥物。細胞生長和藥物生產與培養條件之間的相互關系是過程優化的理論基礎。

可把生物技術制藥工藝分為上下游過程。上游過程是以生物材料為核心，目的在于獲得藥物，包括藥物研發、細胞培養工藝、放大及大規模細胞培養研究等。屬于生物加工過程，如酶工程、基因工程技術、細胞培養工程、發酵工程等。下游過程是以目標藥物后處理為核心，屬于生物分離過程，包括藥物的提取、分離、精制工藝，藥物產品的檢測及質量保證等。

生物技術制藥工藝過程包括菌種或細胞的選育，培養基的特性與制備，無菌化操作，培養工藝的控制等。生物制藥技術的學科基礎包括生物化學、分子生物學、免疫學、酶學、細胞生物學、微生物學等多門學科，為藥物表達和分離純化提供方法和原理。合理設計生產工藝路線需要考慮，高效表達的載體及宿主系統，潔凈室、水系統、空氣等公用設施，在線實時檢測的設備與生物反應器，才能有效地實現過程的控制與優化。

1.1.3.2 化學制藥工藝

化學合成藥物的生產工藝原理、工藝路線的設計、選擇和改造。因為有易燃易爆、有毒的原料與中間體，要求最安全。成本最低，要求最經濟。工藝路線最短，最簡，易于組織生產，要求最便捷。三廢，廢水、氣、渣必須處理并減少到最低，需要無污染、綠色環保工藝。化學制藥涉及課程有有機化學、分析化學、物理化學、藥物化學、藥物合成反應，有機合成，制藥設備與設計等。

化學藥物合成可以分為全合成和半合成兩種。全合成藥物由簡單的化工原料經過一系列的化學合成和物理處理過程制得；半合成藥物是由已知的具有一定基本結構的天然產物經過化學結構改造和物理處理過程制得。

1.2天然提取制藥技術發展

天然提取制藥是指直接從天然材料中使用分離純化等技術制備藥物。現代藥物最初來源于植物、動物和微生物，而且以提取分離為先導。

15～17世紀，歐洲有了金雞納、愈創木、藥喇叭根、古柯果和可可等。

19世紀，掀起了天然提取分離藥物的熱潮，從植物中分離出純的有效化學物質。從鴉片中提取出嗎啡結晶；從吐根中分離得活性成份吐根堿。從金雞納樹皮分離得到了奎寧，成為最早用于治療瘧疾的藥物。從莨菪中提取了阿托品，從古柯葉取得了可卡因；從洋地黃葉子獲得洋地黃甙晶體。

在20世紀50年代后，隨著對動物臟器的有效成分和生理活性物質的全面了解，生產工藝技術提高，改變了原來的混合制劑，生產制備高純度單一特異性組分的生化藥物制劑，如豬牛胰島素、前列腺酶及輔酶、激素、脂類、蛋白質和核酸及其降解產物等。生化藥物品種迅速增加，已成為一類重要的藥物。

由于合成工藝、技術等因素的限制，仍然有些氨基酸、維生素、核苷酸、酶、多糖、脂類等仍然不能合成生產，必須直接從天然材料中提取。還有一些手性藥物和半合成藥物的中間原料也必須從天然材料中直接提取。

1.3 生物技術制藥發展

1.3.1 生物技術藥物

生物技術是整合自然科學和工程科學，生產細胞產品和分子產品，生物技術制藥就是采用生物技術生產制造藥物。生物技術藥物（biotechnology medicine）是利用生物機體、組織、細胞，生產制造或從中分離得到的具有預防、治療和診斷功能的藥品，包括多肽、蛋白質、酶和核酸以及具有生物活性的初級代謝和次級代謝產物、天然活性化合物及其類似物。

20世紀80年代，生物藥物（biopharmaceutical）是指用現代生物技術生產的治療性藥物，它基于重組DNA技術和雜交瘤技術生產的藥物，不包括直接從天然組織、器官、血液等中提取的生化藥物。隨著生物技術的發展，以核酸為基礎的治療性藥物也屬于生物藥物。

在制藥領域，生物技術藥物（biotechnology medicine）、生物技術產品（biotechnology product）、生物技術制品（product of pharmaceutical biotechnology）有時候也互換使用。在相關法規中，經常出現的術語是生物制品 (biologics，biologic product, 中國、美國使用)、生物醫藥產品（biological medicinal product，歐盟使用）。

中國生物制品規程對生物制品的定義：以微生物、寄生蟲、動物毒素、生物組織為起始材料，采用生物學工藝或分離純化技術制備，并以生物學技術和分析技術控制中間產物和成品質量制成的生物活性制劑，包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗體、變態反應原、細胞因子、激素、酶、發酵產品、單克隆抗體、DNA重組產品和體外免疫診斷制品等。在此基礎上，分為預防用生物制品、治療用生物制品和診斷用品三類。預防用生物制品包括疫苗、菌苗和類毒素；治療用生物制品包括抗血清與抗毒素、血液制品、細胞因子與抗體；診斷用品包括細菌學試劑、免疫試劑、臨床化學試劑。

1.3.2 微生物發酵制藥

對微生物進行培養，生產有用化學物質的過程就是發酵過程。采用微生物發酵生產藥物就是微生物發酵制藥。

發酵技術大規模應用于制藥是第二次世界大戰期間，誕生了以抗生素為代表的次級代謝產物的工業發酵。攪拌發酵沉沒法生產成功，提高了供氧和通氣量，同時在菌株選育、培養和深層發酵、提取技術和設備的研究取得了突破性進展，給抗生素生產帶來了革命性的變化。以后鏈霉素、金霉素、紅霉素等抗生素出現，抗生素工業發展迅速。

抗生素生產的經驗也很快應用到其他藥物的發酵生產，如氨基酸、維生素、甾體激素等。工業化生產的微生物藥物主要為抗生素(antibiotic)、氨基酸(amino acid)、維生素(vitamin)、核苷酸和核苷 (nucleotide, nucleoside)、酶(enzyme)、酶抑制劑(enzyme inhibitor)、免疫調節劑(immunomodulator)和受體拮抗劑(receptor antagonist)等。

1.3.3 酶工程技術制藥

酶工程(enzyme engineering)是酶學和工程學相互結合滲透發展形成的，以應用為目的，研發新酶并生產、分離和純化，包括酶的固定化及酶反應器及酶的分子設計等。酶工程制藥的工藝結構緊湊、簡單，高產、成本低，產品收率高、純度好，可重復生產，對環境污染小。

酶工程技術在制藥工業上的主要應用是（1）生物酶用于制備手性藥物。目前已有50多種有機反應可通過微生物實現，廣泛應用甾體激素、氨基酸、維生素和抗生素的制藥中。（2）生物轉化，給已有藥物添加基團，增加藥效和功能。黑根霉一步生物轉化孕酮為11a-羥基孕酮，實現了甾體類激素的工業化生產。（3）固定化酶技術用于制藥。用固定化大腸桿菌細胞（產生青霉素酰化酶）轉化青霉素G、V，除去側鏈生產無側鏈青霉素，即6-氨基青霉烷酸。固定化5-磷酸二酯酶水解轉化酵母RNA，生產5-復合單核苷酸。固定化氨基酰化酶拆分化學合成的DL-氨基酸，產生有活性的L-氨基酸。

1.3.4 細胞培養技術制藥

動植物細胞培養(cell culture)是在離體條件下人工培養基上培養動植物細胞，使之生長繁殖并發育。細胞培養是建立在細胞學說基礎之上，細胞具有全能性，即含物種所有遺傳物質的細胞具有發育成為個體的潛在能力。

最早只有從正常組織中分離的原代細胞才能用于藥物生產，如雞胚細胞和兔腎細胞。以后，二倍體的傳代細胞也可以用于生產，如WI-38和2BS細胞系。在消除了人們對非二倍體細胞的疑慮和擔憂后，異倍體細胞廣泛應用于制藥。

動物細胞培養主要應用于生產人畜病毒疫苗、單克隆抗體、重組基因工程產品等。到目前，FDA批準了約60種動物細胞表達系統生產的生物技術藥物，包括激素類、7種酶類、10種細胞因子、7種凝血因子、19種治療性抗體、5種體內診斷用抗體。其他還有組織工程產品有4種，3種為組織工程皮膚，1種為組織工程軟骨。大規模生產的疫苗有口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰質炎、乙肝疫苗。目前約有70%批準的蛋白質藥物由哺乳動物細胞系統表達制造，而且數目還在不斷增加。動物細胞培養制藥是藥物生產的一個新領域。

1.3.5 基因工程技術制藥

基因工程（gene engineering）制藥是在體外通過重組DNA技術，對生物的遺傳物質基因進行剪切、拼接、重新組合，與適宜的載體連接，構成完整的基因表達系統，然后導入宿主生物細胞內，與原有遺傳物質整合或以質粒形式單獨在細胞中繁殖，并表達活性蛋白質、多肽或核酸等藥物。通過基因工程改造微生物細胞的代謝過程，還可提高抗生素、維生素、氨基酸、核酸、輔酶、甾體激素等藥物的生產能力。

1982年世界上第一個基因工程藥物重組人胰島素獲得FDA批準，由Eli Lilly公司正式生產，推向市場。重組微生物、轉基因動植物為藥物的生產提供了強大生物反應器。人類基因組計劃的完成，以及隨后蛋白質組、代謝組、糖組等后基因組時代的系統生物學技術的出現與發展，為制藥設計提供了更多的功能性數據，對人類戰勝疾病、提高生命質量具有重大意義。

基因工程技術首先在醫藥領域實現產業化，現在有60％～80％集中在醫藥領域，占主要地位的是基因工程藥物的研究和商品化。到2004年2月，美國FDA批準的重組蛋白、核酸和疫苗類生物技術藥物共79種。到2003年底，歐盟EMEA批準了49種基因重組蛋白質藥物、11種基因重組治療性抗體和5種基因重組疫苗。

世界生物技術藥物的銷售額將以年均10％～15％速度增加，基因工程藥物在藥物市場中將占15％。

1.4 化學合成制藥技術發展

1.4.1 全合成制藥

現代制藥工業始于19世紀，染料化學工業的發展和化學治療學說的創立，人們對大量的化工中間體和副產物進行了藥理活性研究，藥物合成突破了仿制和改造天然藥物的范圍，轉向合成與天然產物完全無關的人工合成藥物，如撲熱息痛、磺胺類藥物，開創了化學合成制藥。

20世紀初期，化學藥品大多是在德國。金黃色物質、吖啶類和偶氮染料(Azodyes)抗菌活性的研究，磺胺染料的合成，理化性質和構效關系的研究，總結出了磺胺類藥物的結構與抑菌活性的關系，并由此開發出了數十個臨床應用的磺胺藥。磺胺類藥物的問世在化學合成藥及其臨床治療上具有里程碑的意義，極大地推進了現代醫藥工業的發展。20世紀30年代以后，全合成得到大發展，激素類藥物、維生素C等相繼合成，實現了工業化生產。

1.4.2 半合成制藥

20世紀60年代新型半合成抗生素工業崛起，獲得了青霉素的母核6-氨基青霉烷酸并研究了半合成青霉素和頭孢菌素C，得到了耐酸、耐酶、對耐藥菌株有效的廣譜青霉素，進入了用化學方法對已有的抗生素進行化學結構改造的新時期，開辟了抗生素研制的新途徑。

20世紀70年代，隨著新的有機合成試劑、新的合成技術、新的化學反應的不斷得到應用，促進了藥物合成的發展，使合成藥物的品種和產量迅速增長，生產規模日益擴大。出現的一系列鈣拮抗劑、血管緊張素轉化酶（ACE）抑制劑和3-羥基-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑。

20世紀80年代，諾氟沙星（氟哌酸）正式用于臨床后，引發了對喹諾酮類抗菌藥的研究熱潮，開發出了環丙沙星、洛美沙星、氧氟沙星等一系列抗菌藥物。這些抗菌藥和一些抗生素的成功應用，成為合成抗菌藥發展史上的重要里程碑。

1.4.3 手性制藥

20世紀90年代，在世界上興起了手性藥物。由于數理科學、化學科學、生物科學、計算機科學及技術的飛速發展和相互交叉及滲透，使人們能夠采用更多、更先進的手段來設計和合成新的藥物，合成的新藥向療效高、毒副作用小、劑量小的方向發展。因此，采用單一對映體（即手性藥物）供藥成為現代醫藥工業的一項緊迫任務。手性藥物工業是國際制藥工業新興的一個領域，它將是本世紀制藥工業的一個挑戰。

1.5 制藥工業的發展

制藥工業（pharmaceutical industry）的歷史大約70多年，但一開始就發展很快，目前全世界制藥企業超過10000家，生產制造5000多種藥物，其中約100家為跨國公司。現代制藥工業的發展可追溯到19和20世紀之交，那時只有4種藥物：洋地黃用于治療各種心血管疾病，奎寧用于治療瘧疾，吐根屬植物提取物（活性成分為生物堿）用于治療痢疾，水銀用于治療梅毒，但當時缺乏安全性和有效性。隨著生物學和有機化學的發展，能人工合成某些藥物，如阿司匹林，從而誕生了化學制藥公司，19世紀末成立了Bayer和Hoechst公司。盡管如此，直到20世紀30年代，制藥工業才開始大發展，發現并能化學合成磺胺類藥物，用于治療細菌性感染。20世紀40年代大規模生產青霉素，建立了很多現代領頭制藥企業，如Eli Lilly、Wellcome、Glaxo、Roche等。20世紀70年代以后，出現現代生物技術制藥公司。

世界制藥行業具有以下特征。

（1）并購風云不斷，重組形成更大集團，強強聯合優勢互補，戰略性驅動，企業經營的專業化，企業間的合作。并購數量增加，藥品生產的集中度不斷提高。

（2）研發費用持續上升，投入繼續增大，國際10大制藥公司的年均投入占銷售額的16％左右。1個新藥的研發費用約8－10億美元，但新藥批準上市的數目在下降。研發的難度越來越大，新產品是行業的希望。

（3）重磅炸彈藥物數目持續增加，從1995年到2004年，增長了近4倍。跨國公司更多依賴于重磅炸彈藥物，是企業的主要利潤來源。

（4）生物技術藥物異軍突起。20世紀80年代以前是治療性藥物，20世紀90年代是改善生命質量的藥物，而進入21世紀，將是靶向的蛋白質、多肽和核酸類治療性藥物。

目前，全世界生物技術公司4400多家，主要集中在歐美，美國1444家，歐洲1815家，加拿大472家，亞太地區685家。年產值超過10億美元的生物技術公司有20余家。

美國是應用現代生物技術研制新型藥物的第一個國家，美國70％的生物技術產品集中在生物藥品。美國生物技術制藥形成規模化的公司有Amgen、Biogen、Chiron、Schering-Plough、Eli Lilly、Merker、Genentech、Hoffman-La Roche、Smith Kline Beecham、Genzyme、Ortho Biotech等20余家公司，其中Genentech、Amgen、Biogen、Chiron和Genzyme的銷售額在名列前茅。

1.5.2 中國制藥工業發展

中國制藥工業的發展經歷了從藥店到廠房，再到現代化企業和集團的過程，由于制藥行業的特點，決定了將永遠是不斷重組和兼并的發展過程。

1840年鴉片戰爭后，西藥的引入中國，制藥工業逐漸發展起來。

19世紀50年代開始建立的早期西藥房，經營進口藥，但未形成制藥工廠或企業。清末洋務運動期間，也未見有制藥廠的興建。

20世紀20～30年代，上海、廣州是我國近代制藥工業的發祥地，雖得到一定的發展，受到連年的戰爭和帝國主義的控制，人才匱乏、化學工業與機械工業薄弱等因素，制藥工業十分落后。只有少數中小型制藥廠，生產品種少。而且以制劑生產為主，原料藥的制造很少。生產廠規模不大，設備簡陋，資金很少，產品單一。

1949年新中國成立初期，重視醫藥工業的發展，確定了“以發展原料藥為主”的方針。同時，積極發展藥物制劑生產。1951年試制出第一批結晶青霉素，1958年，以生產抗生素為主的華北制藥廠建成投產，抗瘧藥物氯喹、伯喹和乙胺嘧啶相繼合成并投產。1960年建成太原制藥廠投產磺胺藥。合霉素、氯霉素、磺胺藥等原料藥生產車間相繼建成投產，擺脫進口局面。生化原料藥胰島素、胃蛋白酶、人造牛黃、膽固醇等相繼生產。至1959年，中國建立起化學制藥工業，改造、擴建和新建了一批車間和廠房。開啟了中國制藥的新篇章。

20世紀60－70年代，半合成抗生素尤其是β-內酰胺類抗生素的研究發展十分迅速，半合成的青霉素類品種增加到十幾種。合成了很多抗瘧疾藥物。甾體工業已發展到相當規模，改進工藝，增加品種，提高產量。在地方病用藥、抗腫瘤藥物、維生素類、心血管類、神經系統藥的合成研究或結構改造上都得到了很大發展。

20世紀80年代后，走上了按正規制藥工業管理和發展的道路。1984年原料藥產量5.2萬噸，1986年在原料藥產量6.3萬噸，1987 年原料藥6.5萬噸。1988年主要原料藥產量7.18萬噸，生產青霉素1700噸，1990年產量8.4萬噸。

1.5.3 中國制藥工業的現狀

1.5.3.1 醫藥產業規模

醫藥行業包括化學制藥工業、中成藥工業、中藥飲片工業、生物制藥工業、醫療器械工業、制藥機械工業、醫用材料及醫療用品制造工業、其他工業。從1996年以來，醫藥工業的增長速度高于GDP的增長速度。1991－1995年發展速度最快，年平均增長率為22％，1996－2000年年平均增長率17％，2001－2003年年均增長17.5%。在2004年醫藥行業工業總產值中，化學制藥在醫藥工業中保持主導地位。化學制藥占53.81%，中藥制藥占26.86%，生物制藥占6.4%，醫療器械占8.32%，其他占4.62%。

20世紀90年代以后，中國制藥行業快速發展，根據國家GMP標準對廠房進行設計和建設產品生產的專業化和先進的藥物生產線。由于GMP的強行行業認證，我國制藥企業數量從2001年以來呈下降趨勢，2004年，化學制藥企業2000家左右，其中化學原料藥864家，化學制劑1057家，中藥企業1000多家。

化學原料藥是中國醫藥行業的優勢品種，中國現已成為世界原料藥第二大生產國，青霉素及內酰胺類藥物和維生素的最大生產國和出口國。2004年化學原料藥工業總體規模世界領先，化學制藥行業共實現工業總產值1929.2億元，實現利潤146.8億元。2004年化學原料藥實現工業總產值841.0億元，同比增長12%，利潤50.2億元。2004年生物制藥產業實現工業總產值271.55億元，同比增長24%，完成銷售收入248.95億元，同比增長22.08%，創造利潤25.19億元，工業總產值及銷售收入均高于醫藥制造業總體增長。預測在未來3至5年內，中國生物醫藥產業會保持25％左右速度快速增長。

1.5.3.2 醫藥產品結構

國際制藥業銷售以專利藥為主體，中國正處于從仿制向創新為主體轉換的關鍵階段。從中國醫藥產業的產品結構看，以占制藥工業55%的化學藥為例，中國具有自主知識產權的創新藥僅占約3%。生產化學原料藥近1500種，總產量80萬噸，位居世界第2；生產化學藥品制劑34個劑型、4000余個品種；現代中藥劑型40多種，總產量已達37萬噸，品種8000余種。生產疫苗、類毒素、抗血清、血液制品、體內外診斷試劑等各類生物制品300余種，其中現代生物工程藥品20余種；能生產預防制品約9億人/份。生產包括X射線斷層掃描成像裝置、磁共振裝置等在內的醫療器械11000多個品種、規格；可以生產8大類1200多個規格的制藥機械產品。

2002年全國醫藥總產值占GDP的3.2%。中藥總產值784億元，化學藥2102億元，生物藥物184億元。化學藥占行業的61％，年增長30％；中藥占23％，年增長7％；生物藥物占6％，年增長31％。抗生素生產企業140多家，原料藥產量5萬噸，制劑企業420家，產量588.9億支/瓶/片。維生素原料藥產量8.2萬噸，企業50多家，制劑產量281億支/瓶/片。氨基酸原料藥7.4萬噸，企業20多家，制劑產量1億支/瓶/片。味精生產企業180多家，產量121萬噸。檸檬酸生產企業100多家，產量42萬噸。酶制劑生產企業200多家，產量35萬噸。2002年高于醫藥產業平均水準的是制藥機械(28％)、化學制劑(21％)；低于平均的是中藥(16％)、生物制藥(16％)、衛生材料(15％)、及醫療器械(12％)。

1989年rhuIFN-α1b申報新藥，1993年獲得批準試生產。rhuIFN-α1b采用中國人基因克隆和表達，是我國第一個擁有自主知識產權的上市基因工程藥物。p53基因藥物、結合型滅活甲乙肝疫苗、流感疫苗、重組人血管內皮抑制素注射液等被SFDA相繼批準。目前SFDA批準上市30種生物藥物，正在中檢所完成或正在進行的生物技術藥物約80余種，生物技術制藥的規模正在形成。

1.6 制藥技術展望

制藥行業是一個集約化、國際化程度極高的產業。國外公司在中國設立研發機構，并把生產制造中心向中國轉移。“十一五”時期乃至更長時間我國醫藥市場需求將繼續保持旺盛勢頭。中國醫藥市場今后5年內將以15％～20％的速度發展，到2010年將達到240億美元，成為繼美國、日本、德國和法國之后的世界第5大醫藥市場，2020年將達到1200億美元，超過美國成為全球第一大市場。從制藥業各子行業看，未來5～10年期間，我國醫藥市場將繼續保持以化學藥為主，生物技術制藥已經成為制藥行業的新領域，天然提取制藥有很大發展空間。

1.6.1 創新藥物研究

加大制藥的科研開發投入，研究并擁有自主知識產權的藥物和技術。我國現有常用西藥4 000多種，其中97％屬于仿制國外產品或進口藥。化學制藥須從仿制變為創新，擺脫簡單仿制國外產品的局面，建立新藥創制和相關技術創新的機制。現代生物技術產業是全球重點發展的產業，現在是我國生物制藥發展的關鍵時期。采用組合生物化學、生物分子芯片、細胞組織和動物模型等高通量的方法篩選天然藥物，發現新型治療藥物。利用人類基因組和蛋白質組以及病原生物體的基因組的最新成果，計算機技術，把生物信息學、分子生物學、基礎醫藥學、藥物化學、藥理學等的技術綜合起來，通過突變、生物展示、嵌合、質譜分析等，進行新型藥物的輔助設計和藥物篩選，特別是蛋白質藥物和核酸藥物，研究并建立新型藥物篩選模型及其新技術、新方法，獲得創新性藥物。

通過基因工程技術，改變重組蛋白類藥物的結構，如將單鏈變成雙鏈和增加活性位點，從而增強活性，延長體內的半衰期，達到減小劑量和減少注射次數的目的。已上市的tPA改變成TNK-tPA，將EPO變成ARANESP，改構的重組TNF等。

重組蛋白類藥物、寡核苷酸藥物、合成肽、小分子抗體等的化學修飾，改變藥代動力學和生物利用度，延長半衰期，提高療效，使之成為新一代藥物。

生物分子修飾的化學藥物也獲得了巨大成功，2005 年2 月獲FDA 批準了American Bioscience (ABI) 公司的ABRAXANE (paclitaxel protein-bound particles for injectable suspension)，是利用人白蛋白制成的納米顆粒結合紫杉醇注射制劑，代替了傳統的紫杉醇制劑中容易引起患者過敏反應的有害溶劑，患者無需再注射腎上腺酮來防止溶劑過敏反應，大大加強了紫杉醇的臨床效果和安全性。

1.6.2 抗體工程制藥技術

FDA批準上市的生物藥物中，抗體類藥物所占比例越來越大，2004 年有11 個，3個為全新藥物，其它為新適應癥。抗體類藥物一上市就成為年銷售額逾億美元的重磅炸彈藥 (blockbuster drug)。基于單克隆抗體的治療劑主要的應用領域是癌癥，上市的抗體藥物一半都在營利。目前上市的18 mAbs，在美國有8種已達3千萬美元，其中4種是重磅炸彈藥物，每年獲利超過10億美元。預計單抗藥物的全球銷售額將從2004年的50多億美元增至2010年的150億美元，平均年增長30%。

1.6.3 制藥工藝新技術及其改造

應用現代科學技術改造我國傳統的醫藥工業，使我國制藥行業的經濟實現由速度型向效益型、由粗放型向集約型的根本轉變，用先進的制造技術進行藥物生產。以生物技術等高技術為依托，開發醫藥產品與技術的新領域，加強生物技術制藥的研究、開發和產業化，特別是下游的工藝過程，實現制藥技術結構的戰略轉移。利用基因代謝工程技術和細胞工程原生質體融合技術，與傳統生產技術相結合的方法，改造和構建抗生素、維生素、氨基酸等藥物生產新菌種，提高發酵水平，降低消耗，提高生產效益。把固定化技術與生物轉化相結合，研究大規模半合成抗生素的生產工藝技術，應用現代生產技術生產高效低毒的廣譜抗生素。應用微生物轉化法與酶固定化技術發展氨基酸工業和開發甾體激素，并對現在傳統生產工藝進行改造。

哺乳動物細胞已成為生物技術藥物最重要的表達或生產系統，這種局面將持續并且其所占比例有逐年擴大趨勢。研究適用于大規模藥物生產的動植物和微生物表達系統，提高藥物生產效率的新途徑。動物細胞大規模培養技術仍未很好解決，產業化困難重重。需要加大力度研究，實施產業化工程，有望解決問題。

目前世界上正在開發的新藥中，手性化合物約占70％，正在進行Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗的藥物中，80%為單一異構體。手性藥物技術、反應合成與分離的耦合、化學與生物技術融合正成為新一代的制藥技術。

加強環境保護與質量意識。原料藥的生產的主流將繼續，但要抓住高端原料藥的競爭。研究和推行清潔工藝，推行清潔生產，控制污染總量。提高化學藥物的合成藥水平，特別是提高化工中間體的合成藥技術。撲熱息痛(對乙酰氨基酚)年產近3萬噸、出口近2萬噸，以對硝基氯苯或苯酚為起始原料，工藝落后，污染重，成本高。減少消耗高、污染重、附加值低的原料藥出口，增加技術含量高、附加值高的原料藥和制劑出口。

2.1 微生物發酵與制藥

2.1.1 微生物發酵制藥

2.1.1.1 抗生素的發現

1928年，英國細菌學家Fleming B發現抗菌物質青霉素。在20世紀40年代，一共發現了14種抗生素，50年代發現了20余種，60年代開始了化學結構改造的合成和半合成抗生素階段。目前發現并分離到約9000種抗生素，半合成抗生素約1000種，共萬種以上。但實際生產和應用的只有100余種。

2.1.1.2 發酵制藥種類

發酵：通過微生物的培養而獲得產物的過程。常常用產物說明，冠以某某發酵，如青霉素發酵，維生素發酵等。發酵工程按需氧分為好氧發酵和厭氧發酵。

（1）微生物菌體發酵

微生物菌體發酵是以獲得微生物菌體為目的，如：面包的酵母發酵、單細胞蛋白發酵（利用各種碳源）、真菌類（各種蘑菇、冬蟲夏草）、生物防治劑（蘇云金桿菌，伴孢晶體可以毒殺鱗翅目、雙翅目害蟲）。

（2）微生物酶發酵

微生物酶發酵是以獲得酶為目的的發酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素時，制備中間體6－氨基青霉烷酸。

（3）微生物代謝產物發酵

①初級代謝產物：氨基酸，核苷酸，維生素，有機酸。

②次級代謝產物：最主要的是抗生素。

（4）微生物轉化發酵

利用微生物的一種或多種酶把一種化合物轉變為結構相關的更有價值的產物的生化反應為轉化發酵。

2.1.1.3 制藥微生物的種類

生產藥物的天然微生物主要包括細菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細菌主要生產環狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產生桿菌肽（bacitracin），多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）產生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。細菌還可以產生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacterium flarum）產生谷氨酸，大小菌生產維生素C。

放線菌主要產生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環類（四環素、金霉素、土霉素等）、放線菌素類（放線菌素D）大環內酯類（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大環內酯類（制霉菌素、抗滴蟲霉素等）。酸性、堿性和中性，但以堿性為多。

真菌的曲菌屬產生桔霉素，青霉素菌屬產生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產生頭孢霉素等。脂環芳香類或簡單的氧雜環類，多為酸性化合物。

2.1.2 發酵制藥的基本過程

發酵制藥就是利用制藥微生物，通過發酵培養，在一定條件下，生長繁殖，同時在代謝過程中產生藥物，然后，從發酵液中提取分離、純化精制，獲得藥品。菌株選育（mutation and selection breeding）、發酵(fermentation)和提煉(isolation and purification)是發酵制藥的三個主要工段。主要過程如下。

工藝過程包括發酵和分離純化兩個階段。

生產菌種選育與保存：菌種選育使青霉素的產量由最初20單位提高到80000單位以上。優良菌種應該高產、性能穩定、容易培養。

發酵階段包括生產菌、孢子制備、種子制備、發酵培養，是生物加工工程過程。

孢子制備：保存的菌株，在固體培養基上，復蘇，生長產生孢子。

種子制備：將制備的孢子接到搖瓶或小發酵罐內，培養，使孢子發芽繁殖。對于大型發酵，普遍采用2次擴大培養制備種子，最后接入發酵罐。

發酵：將種子以一定的比例接入發酵罐，培養，是生產藥物的關鍵階段和工序。需要通氣，攪拌，維持適宜的溫度和罐壓。發酵一定周期。期間，取樣分析，無菌檢查，產量測定。加入消泡劑、酸堿控制pH，補充碳源、氮源和前體，促進產量。

分離純化階段包括發酵液處理與過濾、分離提取、精制、成品檢驗、包裝、出廠檢驗，是化學分離工程過程。

發酵液的預處理與過濾：使發酵液中蛋白質和雜質沉淀，增加過濾流速，使菌絲體從發酵液中分離出來。如制霉菌素、灰黃霉素、曲古霉素、球紅霉素藥物存在于菌絲中，要從菌體中提取。如果存在于濾液中，澄清濾液，進一步提取。

提取與精制：吸附、沉淀、溶媒萃取、離子交換等從濾液中把藥物提取出來。精制是濃縮或粗制品進一步提純并制成產品。可重復或交叉使用四種基本方法。

成品檢驗：包括性狀及鑒別試驗、安全試驗、降壓試驗、熱源試驗、無菌試驗、酸堿度試驗、效價測定、水分測定等。

成品包裝：合格成品進行包裝，為原料藥。制劑由制劑車間或廠再分裝。

2.2 制藥微生物生長與生產關系

2.2.1 制藥微生物的生長特性

2.2.1.1 微生物的生長與繁殖

生長和繁殖是兩個完全不同的概念。生長是細胞原生質總量或體積的增加，繁殖是細胞分裂而出現細胞數目的增加。細菌的繁殖方式是無性二等分，而放線菌則主要是通過產生無性孢子，菌絲斷片也可以繁殖。霉菌以無性孢子和有性孢子及菌絲繁殖，酵母進行出芽生殖和裂殖。

2.2.1.2 微生物細胞的分化

分化是菌絲體產生不同形態類型細胞的過程，包括菌體營養細胞的分化和孢子的形成。細胞的分化受遺傳性和環境因素的相互作用所控制。

2.2.2 制藥微生物發酵的基本過程特征

根據菌體生長與產物生成的特征，可把發酵過程分為菌體生長期（cell growth phase）、產物合成期(product formatting phase)和菌體自溶期(cell autolysis phase)三個階段。

2.2.2.1 菌體生長期

菌體生長期（cell growth phase）也稱為發酵前期(fermentation prophase)，是指從接種至菌體達到一定臨界濃度的時間，包括延滯期、對數生長期和減速期。菌體的主要代謝是進行碳源、氮源等分解代謝，培養基質不斷被消耗，濃度減少，而菌體不斷地生長和繁殖，濃度增加。溶氧量不斷下降，達到菌體臨界值時，溶解氧濃度降到最低。培養基的pH也隨著變化，有的菌種，開始適當上升，然后下降；這是首先利用氨基酸作為碳源，釋放出氨，而后氨被利用，pH有下降。有的菌種，開始適當下降，然后上升。這是首先利用糖作為碳源，釋放出丙酮酸等有機酸，而后又被利用所致。培養液的物質消耗或菌體濃度或溶解氧濃度達到一定水平時，其中一個參數就成為菌體生長的限制因素，菌體生長減慢。同時大量生成并積累中間代謝產物，酶受到調控，改變了代謝途徑，菌體的生理狀況發生改變，初級代謝轉向次級代謝，由菌體生長階段過渡到產物合成階段。

2.2.2.2 產物合成期

產物合成期 (product synthesis phase)也稱為產物分泌期(product secretion phase)或發酵中期(fermentation metaphase)，主要進行次級代謝產物或目標產物的生物合成。產物量逐漸增加，生產速率加快，直至最大高峰，隨后合成能力衰退。呼吸強度無明顯變化，菌體在增重，但不增加數目。以菌體DNA含量作為菌體生長繁殖的標準來劃分生長階段和產物合成階段，其界限是很明顯的，即菌體生長恒定（即DNA含量達到定值）就進入產物合成階段。以菌體干重作標準則有交叉，因為菌體數量雖無增加但多元醇、酯類等細胞內含物仍在積累，菌體干重增加。碳源和氮源的分解代謝和產物的合成代謝為主。培養基質的分解代謝與產物合成代謝并重，不斷分解消耗碳源、氮源等，不斷合成產物。對外界變化敏感，容易影響代謝過程，從而影響整個發酵進程。碳、氮、磷酸鹽等物質必須控制在一定有效濃度范圍內，否則，培養基質過剩造成菌體生長繁殖，抑制產物合成；而培養基質不足，菌體生長量少，容易衰老，合成能力也下降。發酵條件如pH、溫度、溶解氧等參數也要嚴格控制。

2.2.2.3 菌體自溶期

菌體自溶期(cell autolysis phase)也稱為發酵后期(fermentation anaphase)，菌體衰老，細胞開始自溶，氨基氮含量增加，pH上升，合成產物能力衰退，生產速率減慢。發酵必須結束，否則產物被破壞，同時菌體自溶給過濾和提取等帶來困難。

2.2.3 制藥微生物的生長動力學

在適宜的培養基中接入菌種，每隔一定時間取樣測定細胞數目和生物量、發酵參數（培養基成分和培養條件）、產物生成等，對發酵時間作圖，就得到了動力學曲線。細胞群體量隨發酵時間的變化曲線為微生物生長動力學曲線。微生物生長動力學曲線描述了微生物由接種到自溶死亡整個過程。發酵過程中培養液會變粘稠，液體的流變學特性影響氧傳遞、熱傳遞和混合等過程。分批式培養過程分為以下幾個時期。

2.2.3.1 延遲期

延滯期（lag phase）或適應期是指接種后，菌體的生物量沒有明顯增加的一段時間。延遲期是菌體適應環境的過程。延遲期時間長短不一，與遺傳和環境因素有關，由菌體與環境相互作用的程度決定的。因不同接種量、不同菌種和菌齡等而表現不同。工業上希望延遲期越短越好，常采用如種子罐與發酵罐培養基盡量接近，對數期的菌體作為種子、加大接種量等方法進行放大培養和發酵生產。

2.2.3.2 對數生長期

對數生長期（log phase）是菌體快速繁殖，生物量的增加呈現對數速度增長的過程。特點是生長速率達到最大值，并保持不變。細胞的化學組成與生理學性質穩定。菌體生長不受限制，細胞分裂繁殖和代謝極其旺盛。可以認為細胞組分恒定，菌體細胞的生長速率與生物量是一級動力學關系

對數期比生長速率達到最大值，

對數期μmax是個常數，因此細胞生物量倍增時間（doubling time）可以表示為：

不同生物由于μmax值不同，倍增時間差異很大。微生物細胞μmax較大，倍增時間約為0.5～5小時。

對于單細胞一分裂為二的基因工程菌，如細菌和酵母，細胞數目倍增時間就是世代時間，td可表示為：

其中，t為n次分裂的總時間，Nt為n次分裂后細胞數目，N0為分裂前的細胞數目。根據對數期中一定時間內的細胞數目的變化，可求出倍增時間。

2.2.3.3 減速期

減速期(decline phase)是指菌體生長速率下降的一段時間。由培養基中基質濃度下降，有害物質積累等不利因素引起。在減速期內，生長速率與菌體濃度仍符合一級動力學關系，但受基質濃度限制。一般生物的減速期較短。

2.2.3.4 靜止期

靜止期或穩定期（stationary phase）是指菌體凈生長速率為零的一段時間。由于營養耗竭、代謝產物或有毒害物質的積累，菌體濃度不增加，細胞的分裂與死亡同步進行，生長速率與死亡速率相等，達到平衡。符合如下方程：

其中kd為死亡速率常數。

最大菌體濃度：

特點：①細胞數達到最大值，②生長速率與死亡速率處于一種動態平衡，③細胞內開始積累貯存物，④大多數芽孢菌形成芽孢，⑤次級代謝產物在此階段合成。

靜止期往往是目標產物生成的主要階段，為了延長穩定期以增加次級代謝產物的合成，產生上常常在此期進行補料培養，增加營養物質，提高產物量，如青霉素發酵時流加葡萄糖。

2.2.3.5 衰亡期

衰亡期（death phase）是指菌體死亡速率大于生長速率的一段時間。表現為細胞自溶、死亡加速，細胞濃度迅速下降。菌體死亡速率也符合一級動力學：

特點：①死亡速率迅速增加，②細胞數量顯著下降，③細胞產生多種形態，如原生質體凝聚，形成菌絲片段。對于分批發酵培養，大多數在衰亡期到來前結束發酵，進行放罐。

2.2.4 基質利用的動力學

在菌體的生長過程，隨著基質逐漸被吸收利用，基質濃度呈現降低。

基質濃度的減少可用基質消耗速率（rs）和比消耗速率（qs）表示

；

比消耗速率表示基質被利用的效率，可用于不同微生物之間的發酵效率的比較。

限制性基質濃度與比生長速率的關系與酶促反應的Michaelis-Menten方程非常相似，可用Monod方程表示：

其中μmax為限制性基質過量時的最大比生長速率，Ks 為飽和常數，相當于1/2最大比生長速率時的基質濃度。

從方程可見，在S很低時，可以近似認為Ks + S＝Ks，則μ =μmax S/Ks，表明基質濃度與比生長速率成正比。在S很高時，可以近似認為Ks + S＝S，則μ =μmax，表明在高基質濃度下，菌體能以最大比生長速率進行生長。

μmax意義在于各種基質對菌體的生長效率，可用于不同基質之間的比較。Ks意義在于菌體對基質的親和力，Ks越小，親和力越大，即越能被菌體良好利用。

2.2.5 生長與產物的關系模型

從菌體生長、能源利用和產物生成速度的變化及其之間的動力學關系出發，Gaden把發酵過程分為三種模型。

I型：菌體生長與產物生成偶聯型(coupling model)。菌體的生長與產物生成直接關聯，生長期與生產期是一致的。產物往往是初級代謝的直接產物，菌體生長、糖的分解代謝、能源利用和產物形成幾乎平行，生長期與生產期是一致的，菌體生長期和產物形成不是分開的。細胞生長、基質消耗、能源利用和產物生成動力學曲線幾乎平行，變化趨勢同步，都有最大值，出現的時間接近。組成型表達的基因工程菌的產物生成屬于此類型，蛋白質產物是細胞能量代謝的結果。乳酸、醋酸等初級分解代謝產物的生成也屬于此類型。所以產物生成速率和比速率分別為：

II型：菌體生長與產物生成半偶聯型（semi-coupling model）。該模型介于偶聯和非偶聯模型之間，產物生成與基質消耗、能量利用之間存在間接關系。產物來自能量代謝所用的基質，但是在次級代謝與初級代謝分開的。在細胞生長期內，基本無產物生成，在生長的中后期生成大量的產物而進入產物形成期。分批發酵出現兩個高峰，先是基質消耗和菌體生長的高峰，然后是產物形成的高峰。如檸檬酸和某些氨基酸的發酵，一部分組成型表達的蛋白質藥物也屬于此類型。產物生成速率和比速率分別為：

；

其中α、β為常數。

III型：菌體生長與產物生成非偶聯型（non-coupling model）。菌體生長期與產物生成期為獨立的兩個階段，先形成物質消耗和菌體生長高峰，幾乎沒有或很少有產物生成，然后進入菌體生長靜止期，產物大量生成，并出現產物高峰。產物可能來自于中間代謝途徑，而不是分解代謝過程，物質消耗和菌體生長之后，菌體利用中間代謝途徑，初級代謝與產物形成是完全分開的，如抗生素、生物堿、微生物毒素的發酵。對于誘導型基因工程菌，往往在靜止期，加入誘導物，基因轉錄和產物表達，所以產物生成速率和比速率分別為：

；

2.2.6 代謝產物的生物合成

代謝（metabolism）是生物體內進行的生理生化反應的統稱。代謝分為分解代謝(catabolism)和合成代謝(anabolism)，前者是指把大分子降解為小分子的過程，為合成代謝提供能量和原料；而后者是指把小分子合成為復雜大分子的過程，滿足細胞生長和分化的需要。

初級代謝是營養物質轉變為細胞結構物質和對細胞具有生理活性作用的物質，為細胞提供能量、合成中間體及其生物大分子的代謝網絡。在初級代謝過程中形成的產物為初級代謝產物（primary metabolite），包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質、脂肪、核酸等。幾乎所有生物的初級代謝基本相同。

次級代謝存在于某些生物中，并在一定時期表達。次級代謝對正常的生長可能不必要，但對抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意義。

2.2.6.1 次級代謝產物生物合成的基本特征

（1）次級代謝產物種類繁多，結構特殊，含有不常見的化合物和化學鍵。如氨基糖、苯醌、香豆素、環氧化合物、生物堿、內酯、核苷、雜環等基團，聚乙烯不飽和鍵、大環、環肽等鍵。

（2）具有種屬特異性，與種屬分類學無關。分類學上相同的菌種能產生不同結構的抗生素，如灰色鏈霉菌既可以產生氨基環醇類抗生素，又可以產生大環內酯類抗生素。分類學上不同的菌種能產生相同結構的抗生素，如霉菌和鏈霉菌均可產生頭孢菌素C。一種微生物的不同菌株產生結構不同的多種次級代謝物，而同一菌株會產生一組結構類似的化合物。

（3）生長期轉向生產期，形態與生理發生變化。次級代謝產物是在細胞生長后期開始形成，當生長受限制時被啟動。完成菌體營養生長期（trophophase）之后，出現次級代謝物合成期（idiophase），其生物合成比生長對環境更敏感，要求更高。次級代謝產物是以初級代謝產物為前體，受到初級代謝的調節。可能是缺乏某種營養成分，菌體生長抑制，啟動了次級代謝物合成。菌體內中間代謝物積累，抑制了初級代謝酶，使之消失或活性下降，誘導了新酶的出現，轉入生產期。芽孢桿菌形成芽孢，放線菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是細胞分化的伴隨現象。

（4）次級代謝產物是結構相似的一組混合物，但活性差異較大。參與反應的酶的底物特異性不強。產生菌利用一種或兩種以上的初級代謝產物合成一種主要的次級代謝產物，并繼續對該產物進行修飾生成多種衍生物。一種次級代謝產物可由兩種或兩種以上代謝途徑合成。

（5）次級代謝產物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色體外，還有細胞質遺傳物質，可能存在于質粒、線粒體基因。遺傳物質的變異和丟失是導致菌種退化和生產不穩定的重要因素，所以具有代謝不穩定性。

2.2.6.2 次級代謝產物的構建單位

微生物合成的次級代謝產物是由微生物代謝產生的一些中間產物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初級代謝產物合成。

把構成次級代謝產物的基本結構單位稱為生源（biogen）。生源直接或間接來源于次級代謝過程的中間產物或初級代謝產物。構建單位包括聚酮體、甲羥戊酸、糖類、不常見的氨基酸（如D－氨基酸、β－氨基酸等）、環多醇和氨基環多醇等。

（1）聚酮體（polyketide）

是含有多羰基的聚合物。許多抗生素如四環素類、大環內酯類、蒽環類抗生素的前體是聚酮體，構成聚酮體的前體與脂肪酸合成的前體相似，基本單位為乙酸、丙酸、丁酸和短鏈脂肪酸，起始單位為乙酰CoA、丙酰CoA、丙二酰CoA、丁酰CoA等，分別供給2、3、4 C單位。經過縮合、脫羧、還原、脫水，每次延長2－3個碳單位，形成多酮次甲基鏈。再還原后形成多種聚酮體。重復脫水得到四環素和蒽環抗生素的母核，環化后形成大環內酯結構。如果內酯環的不飽和鏈較多，則形成多烯大環內酯。

（2）糖類

主要有氨基糖、糖胺、核糖、環多醇和氨基環多醇等，形成抗生素有氨基糖苷類抗生素，如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素等。葡萄糖活化成酮糖，在轉氨酶作用下形成氨基糖。含有氨基糖的抗生素有新霉素B、多烯大環內酯類，含有糖胺的有大環內酯、氨基糖苷類的鏈霉素等。它們的共同前體是葡萄糖。氨基糖是以葡萄糖為前體，合成己酮糖，再經過轉氨作用，將氨基轉移到糖分子上。環多醇和氨基環多醇是葡萄糖酸化、環化及氨基化反應的結果，形成氨基環醇類抗生素。

（3）不常見的氨基酸

不常見的氨基酸是指非蛋白質組成氨基酸，包括D-氨基酸、N-、β-甲基氨基酸、β-氨基酸、亞氨基酸等，如D-谷氨酸、D-苯氨酸、D-纈氨酸、D-亮氨酸、D-鳥氨酸、異絲氨酸、異酪氨酸、肌氨酸、α-氨基己二酸等。這些氨基酸是正常氨基酸通過異構、消旋、修飾而形成的。一些是初級代謝產物。不常見氨基酸是肽類抗生素的構建單位，如桿菌肽、放線菌素D、環孢菌素A等。青霉素、頭孢菌素等生物合成也是利用非蛋白質氨基酸。

（4）莽草酸

莽草酸是芳香族氨基酸、肉桂酸、多酚化合物的前體。由葡萄糖初級代謝生成阿拉伯庚酮糖酸磷酸，脫磷酸、環化形成苯環，再脫水、加氫形成莽草酸。

（5）甲羥戊酸

甲羥戊酸是異戊二烯類、萜類化合物的構建單位，通過乙酸代謝生成。2分子乙酰CoA縮合，生成乙酰乙酰CoA，再與乙酰CoA縮合，生成3-羥基3-甲基戊二酰CoA，再還原生成甲羥戊酸。磷酸化形成活性形式異戊二烯焦磷酸，用于合成生物堿、甾醇和胡蘿卜素等藥物的生物合成。

非核酸嘌呤和嘧啶堿是核苷類抗生素的構建單位，是正常堿基的化學修飾形成。

2.2.6.3 次級代謝產物的生物合成的基本過程

次級代謝產物的合成基本過程包括構建單位的聚合—再修飾—裝配。在此過程中，次級代謝產物的累積受合成途徑中某些酶活性的限制，這些關鍵酶活性大小與產量正相關。

（1）前體聚合

微生物合成生源后，通過縮合反應形成聚酮體、寡肽、聚乙烯等。

各種聚酮體的合成過程相似，只是起始單位和延長單位不同。聚酮體是2－6個二碳單位的聚合反應的結果，酮基被保留，或只是還原為羥基。聚酮體可直接形成環，如四環素類和大環內酯類。進而被修飾，與相應基團如氨基糖、糖胺等結合，形成結構和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再與8個丙二酰單位縮合形成9酮化合物，再轉化為中間體三環化合物。甲基化、還原、脫水、加氫、氧化形成4氧脫水四環素，加氯形成4氧脫水氯四環素，轉氨形成4氨基脫水氯四環素，再甲基化形成脫水氯四環素，脫氫氯四環素，最后形成氯四環素。大環內酯是2－4碳單位縮合而成。

氨基酸的聚合有三種形式：氨基酸活化成磷酸酯，再被酶催化縮合，如谷胱甘肽；蛋白質的核糖體模板合成途徑；多酶復合物將氨基酸活化后，按硫模板或非核糖體機理縮合，形成肽鏈。氨基酸與ATP反應，在羧基上形成腺苷單磷酸酯被激活。氨基酸被轉移到酶的巰基上，形成硫酯鍵。硫酯鍵斷裂，提高能量，使2個氨基酸之間形成肽鍵（羧基與氨基結合）。依次，形成多肽鏈。如短桿菌肽S是由2條5肽首尾連接而成。

（2）結構修飾

包括糖基化、酰基化、甲基化、羥基化、氨基化、氧化還原等，使抗生素產生了共存的系列類似物。在聚酮體鏈延長的過程中，伴隨許多基團的化學修飾，如引入氧、氯原子、甲基等，再以糖苷鍵與糖類物質連接，酰胺鍵與氨基酸連接，形成各種抗生素。如四環素類，先形成聚酮體，在C7位發生氯化則是金霉素，在C5位上先氧化后還原則是土霉素。

（3）裝配

合成各個組分后，需要按一定順序在特異酶作用下組裝，才能形成有活性的藥物。

2.3 制藥微生物菌種的建立

發酵生產藥物，需產量高的菌種，自然界中的菌種趨向于快速生長和繁殖，而發酵工業需要大量積累產物，因此菌種選育很重要。常規方法是利用天然變異，從中選擇優良株系。隨后物理因子（紫外線、X射線、中子、激光等）和化學因子（烷化劑、堿基類似物等）和生物因子（噬菌體、抗生素）誘變育種。20世紀80年代，以原生質體融合的雜交育種和基因工程育種，90年代以后，可以用基因組shuffling育種。

2.3.1 新藥生產菌的選育

2.3.1.1 自然分離

（1）樣品的采集與處理

從大陸土壤、海洋水體等環境中采集樣品，表層土壤（0－10cm），海洋（0－100m）。根據分離目的和微生物的特性預處理。較高溫度（40－120℃）處理幾十分鐘至幾小時，甚至幾天，可分離到不同種類的放線菌。化學試劑如SDS－酵母膏，CaCO3、NaOH處理，減少細菌，有利于放線菌分離；乙酸乙酯、氯仿、苯處理，除去真菌。

（2）分離方法

選擇適宜的培養基，滿足微生物營養需要和pH條件，添加抑制劑，有利于富集。加入抗真菌試劑和抗細菌抗生素，可以富集放線菌。

分離方法有稀釋法和濾膜法。用無菌水、生理鹽水、緩沖液等稀釋后，涂布平板。用0.22－0.45 μm培養，細菌在膜上，放線菌菌絲可穿透，進入培養基。放線菌可在25－30℃、32－37℃或45－50℃下培養，7－14天至1月。

（3）活性測定

非致病菌為對象，采用瓊脂擴散法測定活性，篩選生物活性物質。可以使用耐藥和超敏菌種。用HPLC、LC－MS等，分析鑒定活性物質。其他現代的篩選技術如靶向篩選、高通量篩選、高內涵篩選等可以結合使用。

2.3.1.2 自然選育

在生產過程中，不經過人工誘變處理，根據菌種的自發突變而進行菌種篩選的過程，叫自然選育或自然分離。自然選育的常用方法是單菌落分離，需要反復篩選，確定生產能力比原菌株高的菌種。基本過程如下：

菌種→單孢子或單細胞懸液→適當稀釋→瓊脂平板分離→挑單個菌落進行生產能力測定→選出優良菌株。

自然選育簡單易行，可達到純化菌種、防止退化、穩定生產水平和提高產量的目的。但效率低，增產幅度不會很大。

2.3.1.3 誘變育種

誘變育種是人為創造條件，使菌種發生變異，從中篩選優良個體，淘汰劣質個體，當前菌種選育的一種主要方法。其特點是速度快、收效大、方法相對簡單。但缺乏定向性，要配合大規模的篩選工作。

（1）誘變劑

誘發突變的因素有物理、化學和生物三類。物理因素包括各種射線，紫外線、快中子、X射線、R射線、激光、太空射線等。化學因素包括堿基類似物，2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤等；與堿基發生反應的物質，硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥、羥胺等；DNA嵌合劑，丫啶類，溴化乙錠等。生物因素包括噬菌體、質粒等。這些因素最終使遺傳物質DNA的一級結構發生變化，從而導致性狀變異。

（2）誘變育種方案的設計

誘變育種整個過程涉及誘變和篩選兩個階段，甚至是不斷多輪重復。首先制定誘變方案，進行誘變實驗。選擇好出發菌株（starting strain），產量較高，對誘變劑敏感。進行誘變處理，交叉使用多種誘變劑比一種效果更好，對誘變劑進行合理組合。根據致死率和誘異率，確定適宜的誘變劑量。最好是既能增加變異范圍，又有大量的正向變異。其次，確定篩選目標和方案，進行篩選。除高產外，還有生長速度快，產孢子多，有效利用廉價碳源等。篩選應該施加一定的選擇壓力（selective pressure），如抗生素、基質濃度等，或生理作用，有針對性進行。

2.3.1.4 雜交育種

雜交育種是兩個不同基因型的菌株通過接合或原生質體融合使遺傳物質重新組合，再從中分離和篩選具有新性狀的菌株。帶有定向育種的性質。

方法1：接合（conjuction）

直接混合培養兩個菌種，通過接合而形成異核體（heterocaryon, 菌絲中含有遺傳特性不同的細胞核），進而產生分生孢子。個別細胞核發生融合，得到雜合二倍體，極少數發生染色體交換，得到重組型二倍體，進而篩選得到高產菌株。

方法2：原生質體融合(protoplast fusion)

用去壁酶處理將微生物細胞壁除去，制成原生質體，在高滲條件下，用聚乙二醇（PEG）促進原生質體發生融合，再生細胞壁，從而獲得異核體或重組子，這一技術叫原生質體融合。

原生質體融合育種首先要建立細胞再生體系，這樣保證了融合后的原生質的有效再生。一般要求兩個親本菌種具有明顯的遺傳標記，便于融合后的有效篩選。除了PEG化學促進融合外，還有電融合等其他物理方法，融合效果都很好，但需要相應的儀器。鏈霉菌的原生質體融合的基因組重組率高達20％。最近，基于原生質體融合的基因組shuffling是細菌單染色體細胞的有效育種方法，屬于分子定向化育種范疇。

2.3.1.5 基因工程技術育種

采用基因工程技術即基因克隆與表達技術，過量表達或抑制表達某一個或一組基因，調控代謝過程，實現目標產物的高效表達。一般希望外源基因整合到染色體中，以便穩定遺傳。在傳統抗生素、氨基酸、維生素發酵的育種中具有重要意義。

2.3.1.6 基因組shuffling技術

DNA shuffling（重排，改組，重洗） 又稱有性PCR(sexual PCR)，是一個反復突變和重組的循環過程，從一組相關基因的隨機片段（來自不同種類生物，具有相關功能的基因），通過無引物PCR的方式重新組合，裝配新功能重組（recombination）基因，生產有用或有潛力的新基因產品。這些基因，再次被酶切成片斷，再一次重組成新的組合基因，此過程一再重復，一直到具有高品質的蛋白質產生。

基因組shuffling與DNA shuffling類似，操作對象為單染色體組成的基因組。原生質體融合時，基因組發生重組形成突變候選庫，經過篩選得到生產途徑和表型改進的菌株，即經濟適用的菌株。以前的隨機突變和選擇（至少10－20輪）為工業微生物篩選了優良菌株，但對表型改進仍然困難，因為表型是由分布在基因組中的一批基因決定。基本過程如下：

（1）隨機突變獲得單個性狀優良的菌株

（2）多個菌株的原生質體混合、融合、再生，形成第一個融合庫（F1）

（3）再次重復循環融合，得到融合庫F2、F3、F4

（4）篩選鑒定

基因組shuffling的關鍵是起始突變體的選擇、遺傳重組的效率、選擇方法的靈敏性。已經在泰樂霉素生產菌的改造、蛋氨酸生物合成途徑的進化等方面取得明顯效果。

2.3.2 菌種保存

目的：保持長期存活、不退化、不喪失生產能力。

保存原理：使其代謝處于不活躍狀態，即生長繁殖受抑制的休眠狀態，可保持原有特性，延長生命時限。

2.3.2.1 斜面低溫保存

也稱定期移植保存，可用于生產菌種的短期保存。利用低溫降低菌體的新陳代謝，使菌種的特性在短時間內保持不變。菌種接在適宜的平板培養基上或斜面試管中，在生長溫度下，生長至旺盛期，然后置于低溫冰箱內，一般4℃，濕度小于70％，進行保存，每隔一定時間移植轉移一次。該方法的優點是操作方便，使用便利，缺點是保存時間短，容易發生變異。

2.3.2.2 液體石蠟密封存保藏

生長好的斜面菌種或穿刺培養物，加入滅菌的液體中性石蠟油，覆蓋厚度1cm左右，封閉管口，然后置于4℃低溫下保存，約1年。石蠟封存，可減少水分蒸發并隔絕了氧氣，增加了保存時間。但該方法不適于能利用石蠟油的菌種。

2.3.2.3 砂土管保藏

黃砂：泥土＝3：2或1：1，滅菌并無菌檢查后與孢子混合，使孢子吸附在砂土上。置于干燥管中，真空泵抽氣干燥后，使砂土外形松散。置于干燥器中，冰箱低溫下保存，可達一年以上。對分生孢子霉菌、放線菌和芽孢細菌，可保存5－10年。只適宜于有孢子或芽孢的菌種，不適用于只有菌絲的真菌和無芽孢的細菌和酵母保存。砂土起保存載體的作用。硅膠、濾紙、瓷珠等可用于保存。

2.3.2.4 冷凍干燥保藏

生長好的菌體與細胞保護劑（脫脂奶或血清等，見表）混合，制成菌懸液在－35℃～－45℃（酒精或干冰）下預凍15分鐘至2小時，使細胞快速凍結而不受破壞，保持細胞的完整性。然后低溫真空干燥。封瓶后，低溫避光保存。保護劑的作用在于降低細胞的冰點，減少冰晶對細胞的傷害，有利于菌體的復蘇。冷凍干燥保存時間長，一般5～10年，多達15年。

2.3.2.5 液氮低溫保藏

菌體培養物，加入細胞冷凍保護劑5～10％甘油和二甲基亞砜（DMSO）制成孢子或菌懸液，濃度一般大于108個/ml。分裝于小的安瓿瓶或聚丙烯小管后，密封。先降至0℃，再以每分鐘降1℃的速度，一直降至－35℃，然后放液氮罐中保存。也可直接置于液氮中速凍，然后在液氮中保存或在－80℃冰箱中保存，是目前最可靠的一種長期保存方法。保護劑的作用在于降低細胞的冰點，減少冰晶對細胞的傷害。

2.3.3 菌種保存機構

2.3.3.1 中國典型培養物保藏中心

中國典型培養物保藏中心：China Center for Type Culture Collection (CCTCC)，(武漢大學保藏中心)。

2.3.3.2 中國科學院典型培養物保藏委員會

中國普通微生物菌種保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)

中國工業微生物菌種保藏管理中心：China Center of Industrial Culture Collection（CICC）

抗生素菌種保藏管理中心（CACC）：

中國醫學微生物菌種保藏中心：National Center for Medical Culture Collection (Bacteria)，CMCC

2.3.3.3 國外主要保藏機構

WFCC：World federation for culture collections, http://www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml

ATCC: American Type Culture Collection, http://www.atcc.org/

IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan

NCTC: National Collection of Type Culture, London, UK

2.4 培養基制備

培養基（medium）是供微生物生長繁殖和合成各種代謝產物所需要的按一定比例配制的多種營養物質的混合物。培養基的組成和比例是否恰當，直接影響微生物的生長、生產和工藝選擇、產品質量和產量等。

2.4.1 培養基的成分

2.4.1.1 碳源

凡是構成微生物細胞和代謝產物中碳素的營養物質均稱為碳源。包括糖類、醇類、脂肪、有機酸等。糖類有單糖（葡萄糖，果糖）、雙糖（蔗糖、乳糖）、多糖（淀粉、糊精），常用葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜。糖蜜是制糖的副產物，主要成分為蔗糖，是價廉物美的碳源。脂肪有豆油、棉籽油和豬油，醇類有甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇，長鏈碳氫化合物以石油產品的正烷烴，14-18碳的混合物。以脂肪作為碳源時，必須提供足夠的氧氣，否則會引起有機酸積累。

2.4.1.2 氮源

凡是構成微生物細胞和代謝產物中氮素的營養物質均稱為氮源。可分為有機氮源和無機氮源兩類。常用有機氮源有黃豆餅粉（最常用）、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、尿素等。有機氮源含有豐富的蛋白質、多肽和氨基酸，水解后提供了主要的氨基酸來源。同時，含有少量的糖類、脂肪、無機鹽、維生素、某些生長因子等，微生物生長更好。此外，含有代謝的前體，有利于產物的生成。

常用無機氮源有銨鹽、氨水和硝酸鹽。銨鹽中的氮可被菌體直接利用。硝酸鹽中的氮必須還原為氨才可利用。無機氮源可以作為主要氮源或輔助氮源，氨鹽比硝酸鹽更快被利用。

根據氨鹽利用后，殘留物質的性質，把無機氮源可分為生理酸性物質和生理堿性物質。生理酸性物質是代謝后能產生酸性物質，如(NH4)2SO4利用后，產生硫酸。生理堿性物質是代謝后能產生堿性物質，如硝酸鈉利用后，產生氫氧化鈉。生產中常常加入無機氮源來調節pH值，一舉兩得。

2.4.1.3 無機鹽和微量元素

無機鹽（mineral salt）和微量元素(trace element, microelement)是生理活性物質的組成成分或具有生理調節作用，磷（核酸）、硫、鐵（細胞色素）、鎂、鈣（調節細胞膜透性）、錳、銅、鋅（輔酶或激活劑）、鈷、鉀、鈉（調節滲透壓）、氯。一般低濃度起促進作用，高濃度起抑制作用。各種鹽成分的使用濃度見表。

生物對磷酸鹽的需要量較大，但在不同階段是不同的。微生物生長的磷酸鹽對次級代謝產物合成有重要影響。對抗生素發酵，采用生產亞適量（對菌體生長不是最適合但又不影響其生長的量）的磷酸鹽濃度。

對于特殊的菌株和產物，不同的元素具有獨特作用，銅能促進谷氨酸發酵，錳能促進芽孢桿菌合成桿菌肽，氯離子促進金霉素鏈霉菌合成四環素。鈷是維生素B12的組成元素。加入微量鈷，促進VB12產量，也能增加鏈霉素、慶大霉素的產量。

2.4.1.4 水

菌體細胞的主要成分，營養傳遞的介質。良好導體，調節細胞生長環境溫度。

2.4.1.5 生長因子

生長因子（growth factor）是指微生物生長不可缺少的微量有機物，包括氨基酸、維生素、核苷酸、脂肪酸等。一般天然成分中含有，無需添加。但對于營養缺陷型（氨基酸、核苷酸）菌株，必需添加。

2.4.1.6 前體與促進劑

前體是加入到發酵培養基中的某些化合物，能被直接參與產物的生物合成，組成產物分子的一部分，而自身的結構沒有發生多大的變化。前體明顯提高產品產量和質量，一定條件下還能控制菌體合成代謝產物的方向。前體不僅有毒性，而且被菌體分解，因此多次少量流加工藝。

在抗生素等次級代謝產物的發酵中，經常添加前體(precursor)和促進劑(accelerant)，以提高產量。前體可以是產物的中間體，也可以是其中的一部分。

2.4.1.7 消沫劑

消除泡沫，防止逃液和染菌。一般為動植物油脂和高分子化合物。

2.4.2 培養基的種類

培養基的種類繁多，按組成、狀態、用途分類。

按組成分類：合成培養基(synthesized medium)，成分明確。天然培養基(natural medium)，成分不完全明確，有一些天然物質。半合成培養基(semi-synthesized medium)，用途分為選擇性培養基(selective medium)、鑒別性培養基(identification medium)、富營養培養基(nutrient medium)等，

按物理性質分類：固體培養基(solid medium)，半固體培養基(semisolid medium)，液體培養基(liquid medium)。

按發酵過程中所處位置和作用分為以下幾類。

2.4.2.1 斜面或平板固體培養基

斜面固體培養基（solid medium）包括細菌和酵母的固體斜面或平板培養基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養基。在液體培養基添加1.0％～2.0%的瓊脂粉（agar）制成固體培養基。作用是提供菌體的生長繁殖，形成孢子。特點是菌體生長迅速，產生優質大量的孢子，但不能引起變異，營養豐富。單細胞培養基要含有生長繁殖的各類營養物質，包括添加微量元素、生長因子等。絲狀菌的孢子培養基，基質濃度較低，無機鹽濃度適量，以利于孢子形成。營養不宜太豐富，否則不易產生孢子。

2.4.2.2 種子培養基

種子培養基（seed medium）是供孢子發芽和菌體生長繁殖，包括搖瓶和一二級種子罐培養基，為液體培養基。作用是使種子擴大培養，增加細胞數目，生長形成強壯、健康和高活性的種子。培養基成分必需完全，營養豐富，含有容易利用的碳、氮源和無機鹽等，但總體濃度不宜高。孢子發芽快，細胞生長迅速，能繁殖大量的菌體，菌體健壯，提高各種代謝酶活力。由于生長時間較短，生長快速，為了縮短發酵的停滯期，種子培養基要與發酵培養基相適應，成分應與發酵培養基的主要成分接近，不能差異太大。

2.4.2.3 發酵培養基

發酵培養基(fermentation medium)是提供微生物進行目標產物的發酵生產，不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標產物，是發酵生產中最關鍵和最重要的培養基。要求是接種后菌體能迅速生長到一定密度或濃度，又能合成目標產物。營養物質濃度要高些，在組成上，不僅要有滿足菌體生長所需的物質，還要有特定的元素、前體、誘導物和促進劑等對產物合成有利的物質。不同菌種和不同產物，對培養基的要求差異很大。供菌體生長繁殖和合成大量代謝產物用，組成應豐富完整，營養成分濃度和粘度適中。

2.4.2.4 補料培養基

補料培養基(fed medium)是發酵過程中添加的培養基。為了工藝條件穩定，有利于微生物的生長和代謝，延長發酵周期，提高目標產物產量，經常采用前期培養基稀薄一些，從一定時間開始，間歇或連續補加各種必要的營養物質，如碳源、氮源、前體等。補料培養基一般按單一成分配制，在發酵過程中各自獨立控制加入，或按一定比例制成復合補料培養基，再加入。

還有一些特殊用途的培養基，如分離純化培養基、原生質體再生培養基、鑒別培養基、生物檢測培養基（測定抗生素生物效價）。

2.4.3 影響培養基質量的因素

對于發酵過程首先要選擇合適的培養基。培養基的組成和配比是否恰當對菌體的生長、產物的生成、提取工藝的選擇、產品的質量和產量等都有很大的影響。培養基都是由水、碳源、氮源、無機鹽等組成，具有一定pH和滲透壓。對某一菌種和產品而言，究竟用哪些原料作培養基還需經過一系列實驗的摸索才能確定一種既有利于基因工程菌生長又能保證得到高產優質產品的較為理想的培養基配方。另外，工業生產培養基所用的原材料還必須來源豐富、價格低廉、質量穩定。當然，一種好的培養基配方還應隨菌種的改良、發酵控制條件和發酵設備的變化而作相應的變化。

2.4.3.1 原料質量

培養基所用原料主要為復合大分子化合物，如玉米獎、黃豆餅粉、花生餅粉、淀粉等農副產品和蛋白胨、酵母粉等，常常因加工原材料的品種、產地、加工方法、貯存條件不同而質量差異較大。化學原料如各種無機鹽類化合物，雜質含量也不相同，其純度對培養基的質量也會造成影響。

培養基原料的選擇應注意碳源和氮源種類和數量的影響。雖然大多數碳源對菌種生長的能力相似，不同碳源對菌種生長的能力和產物的生產能力很不相同，對產物的生成影響很大。碳源過多，有機酸形成多，容易引起pH降低；碳源過少，引起菌體衰老和自溶。選擇氮源也很重要，不同微生物對最適氮源的要求不同。同時要注意碳氮配比，氮源過多，會使營養生長過旺，pH偏高，不利于產物的積累；反之，氮源不足，菌體量生長少，也會影響產物生產。速效和緩效成分相互配合，發揮綜合優勢。不同生長階段，對碳氮源的要求也不不同，要根據微生物菌種來確定。微生物對pH的要求在于，處于一定酸堿環境下，才能生長發育和生存。配制培養基時可加入酸堿性物質搭配，在生長過程中，根據工藝和設備，控制在最適范圍之內。

對原料要試驗選擇，一旦選定后，不宜隨意更換，保持穩定原料來源。在更換原料時，必需進行一系列試驗，確保產量和質量的控制和穩定性。

2.4.3.2 水質

深井水、自來水、地表水、蒸餾水。水是培養基的主要成分，恒定水源和恒定的水質很重要。水質的主要參數包括pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物特別是重金屬的種類和含量。優良基因工程菌有時不能高產，可能是劣質水造成的，生產中要注意。對水質定期化驗檢查，使用符合要求的水質配制各種培養基。菌種和種子培養基可以用蒸餾水，而生產用水必需使用超純水，可避免相應的污染。

2.4.3.3 滅菌的影響

高壓蒸汽滅菌是生產中常用方法，但控制不當，很容易直接影響培養基的有效成分甚至是活性。較高溫度下長時間滅菌，營養成分會破壞，甚至產生有毒物質。磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應，生成沉淀或絡合物，降低了對磷酸和銨離子的利用。維生素、激素等在高溫下被分解破壞、失活。應該將糖與其他組分分開滅菌。有研究顯示糖類單獨濕熱滅菌，基本消除焦化現象。在能達到完全滅菌的情況下，采用高溫快速滅菌是有效的措施。

滅菌會引起培養基的pH變化。一般情況下，滅菌會使LB培養基的pH增加0.1～0.2,糖類滅菌造成的酸化也很嚴重。

2.4.3.4 培養基的黏度

培養基中的固體不溶性成分，如淀粉、黃豆粉等增加了培養基的黏度，不僅影響發酵的通氣攪拌等物理過程，而且直接影響菌體對營養的利用，也給目標產物的分離提取造成困難。高黏度的培養基，也不易徹底滅菌。生產中可用精料發酵、基礎原料用酶水解，降低大分子物質，或補加滅菌水，來降低黏度。

2.4.4 發酵培養基的配制

2.4.4.1 一般原則

（1）生物學原則：根據不同微生物的營養和反應需求，設計培養基。營養物質組成較豐富，濃度適當，滿足菌體生長和合成產物的需求。各種成分之間比例恰當，特別是有機氮和無機氮源，C/N比。一定條件下，各種原材料之間不能產生化學反應。具有適宜的pH和滲透壓。

（2）工藝原則：不影響通氣和攪拌，又不影響產物的分離精制和廢物處理，過程容易控制。

（3）低成本原則：原材料要因地制宜，來源方便，豐富，質量穩定，質優價廉，成本低。

（4）高效經濟原則：生產安全，環境保護，高質量，最高得率，最小副產物。

2.4.4.2 培養基的設計基本思路

（1）根據他人的經驗和成分，初步確定培養基的成分，作為研究的起始培養基。

（2）單因素實驗，確定最適宜的培養基成分。

（3）多因素實驗，進行各成分之間濃度優化和最佳配比。如均勻設計、正交實驗和響應面分析等統計學方法。

（4）從搖瓶、小型發酵罐，到中試，最后放大到生產罐。

（5）綜合考慮各種因素，產量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產配方。

2.4.4.3 理論計算與定量配制

微生物生長和生產可用下列表達式表示：

碳源和能源＋氮源＋其他營養物質→細胞＋產物＋CO2＋H2O＋熱量

如果能進行定量表達，就可計算得到一定細胞生物量所需最小的營養物質。如果已知生物量與產物之間的特殊表達關系，就可以計算獲得一定產量的最小底物濃度。可參考微生物的化學元素組成（表），做初步計算培養基配方。由于培養基成分的復雜性和所起作用的差異，一般針對碳源和氮源進行轉化率計算和分析。

轉化率是單位質量的原料生產的產物量或細胞量。理論轉化率是理想狀態下，根據代謝途徑的物料衡算結果，而實際轉化率是發酵過程中實際測量得到的數值。所以理論轉化率高于實際轉化率，而使實際轉化率靠近理論轉化率是發酵控制的最終目標。理論衡算是建立代謝過程非常清楚的基礎之上，但很困難，所以對代謝過程簡化后，可以定量計算。

工業生產用培養基的確定需要大量細致和周密的試驗研究。目前還無法從生化反應的基本原理來推斷和計算出最佳培養基配方，只能根據生理學和生物化學的基本理論，參照前人所用的經驗培養基，結合生物學和產品特征要求，對培養基的成分進行深入試驗。

2.5 滅菌工藝

雜菌（contaminated microbe）：對于發酵生產過程，除生產菌以外的任何生物微生物。

污染（contamination）：感染雜菌的發酵體系。

污染的后果：雜菌不僅消耗營養物質，干擾發酵過程，改變培養條件，引起溶解氧和培養基黏度降低等變化；還會分泌一些有毒物質，抑制生產菌生長；雜菌分泌酶，分解目標產物或使之失活，產量大幅度下降；噬菌體（phage）的污染引起溶菌；雜菌污染直接影響后續工序的有效進行，甚至是產品的質量。

消毒(disinfection)：指用物理或化學方法殺滅或清除病原微生物（pathogen），達到無害化程度的過程，只能殺死營養體，而不能殺滅芽孢體，殺滅率99.9%以上。

殺菌：殺滅或清除病所有微生物的過程，殺滅率99.9999%以上。

滅菌（sterilization）：是指用物理或化學方法殺滅或清除物料或設備中所有生命物質的技術或工藝過程，達到無活微生物存在的過程，微生物殺滅率99.999999%以上。

滅菌是十分重要的工序，包括培養基、發酵設備及局部空間的徹底滅菌、通入空氣的凈化除菌。常用的滅菌方法主要有化學滅菌、物理滅菌兩類。

2.5.1 常用滅菌方法與原理

2.5.1.1 化學滅菌

化學滅菌是指用化學物質殺滅生物細胞的滅菌操作。常用化學滅菌劑有氧化劑類如高錳酸鉀、過氧化氫等，鹵化物類如漂白粉、氯氣等，有機化合物如70％～75％乙醇、甲醛、戊二醛、環氧乙烷、2％新潔爾滅、3%～5％石炭酸等。使蛋白質變性，酶失活，破壞細胞膜透性，細胞死亡。化學滅菌主要適合用于皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區域的臺面、地面、墻壁及局部空間或某些器械的消毒。

2.5.1.2 輻射滅菌

物理滅菌包括使用各種物理條件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進行滅菌，效果好，操作方便，廣泛使用。各種物理射線對生物細胞具有殺傷能力，其中以紫外線最常用。原理在于核酸和蛋白質在紫外區有強烈的吸收，DNA吸收紫外線后，會形成嘧啶二聚體，如胸腺嘧啶二聚體，分子之間的交聯改變了DNA的功能，從而導致生物細胞死亡。但紫外線穿透力極低，只適宜于表面滅菌，常用于一定空間的空氣滅菌，如無菌室、超凈工作臺等的滅菌。

2.5.1.3 干熱滅菌

在高溫120℃以上，蛋白質、酶、核酸、生物膜等生物大分子變性、凝聚破壞，甚至是降解，生物細胞破裂，內容物釋放，生物體死亡。對于干熱滅菌，足夠長的時間和足夠高的溫度，都可以殺滅生物體。干熱滅菌效果沒有濕熱滅菌好，是實驗室常用的器皿的方法。工業采用160℃、2h，或170℃、1h干熱空氣，用于需保持干燥的器械、容器的滅菌。溫度越高，時間相應縮短。

2.5.1.4 蒸汽滅菌

濕熱滅菌效果優于干熱滅菌，原因在于濕熱狀態下，穿透力強，蒸汽冷凝時釋放出大量能量，使蛋白質、核酸等內部的化學鍵破壞、降解，導致生物體死亡。一般在115℃～140℃，保持一段時間，可以殺死各種生物體。由于蒸汽價格低廉，來源方便，效果可靠，操作控制簡便，因此濕熱滅菌常用于培養基和設備容器的滅菌。常用條件為115℃～121℃，壓力1×105Pa，維持15～30分鐘。芽孢是一種休眠體，外面有厚膜包裹，耐熱性很強，不易殺滅。因此在設計滅菌操作時，經常以殺死芽孢的溫度和時間為指標。為了確保徹底滅菌，實際操作中往往增加50％的保險系數。

滅菌過程中，高溫會使營養成分受到一定程度破壞。滅菌活化能大大高于營養物質分解活化能，因此應盡量減少滅菌時間和溫度。從微生物死亡動力學方程可以看出，隨著溫度的升高，微生物的死亡速率加快，而且比營養物質分解速率快得多，因此高溫短時滅菌可達到相同滅菌效果，而營養物質破壞大大減少。這就是高溫短時滅菌的理論基礎。實踐證明，在能達到完全滅菌的情況下，采用高溫短時滅菌是有效的措施。

培養基的pH、原料成分及泡沫對蒸汽滅菌效果有一定影響。不同原料所含雜菌數量不同，pH在6～8內，蛋白質、糖、油脂等物質的存在，對微生物起包裹作用，使微生物對熱的抗性增加，不易死亡。pH在6.0以下，微生物對熱較敏感，容易殺死，低pH下滅菌時間可縮短。顆粒的存在容易形成滅菌的死角，泡沫的操作阻礙了蒸汽的流動，并形成隔熱層，滅菌效果大大降低。這些因素在滅菌操作中應該予以重視。

2.5.1.5 培養基的過濾除菌

有些培養基成分受熱容易分解破壞，不能使用蒸汽滅菌，常常采用過濾器除菌。常見的有蔡氏細菌過濾器、燒結玻璃細菌過濾器和纖維素微孔過濾器等。蔡氏細菌過濾器采用石棉濾板，燒結玻璃細菌過濾器的除菌用規格為小孔徑的燒結玻璃。纖維素微孔濾膜有醋酸纖維素和混合纖維素等幾種質地，具有一定的熱穩定性和化學穩定性，孔徑規格為0.1～5μm不等，一般選用0.22μm，進行溶液過濾除菌。

2.5.2 培養基的滅菌

2.5.2.1 分批滅菌操作

將配制好的培養基輸入發酵罐內，直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至發酵要求的溫度，這一工藝過程稱為分批滅菌或實罐滅菌。特點是不需其他的附屬設備，操作簡便，國內外常用。缺點是加熱和冷卻時間較長，營養成分有一定損失，罐利用低。為中小型生產企業采用。

使物料溶脹并均勻受熱，至90℃以上，通入蒸汽，達到121℃開始計算維持時間，生產中習慣采用30分鐘。快速冷卻，以減少營養物質的破壞，滅菌結束時，立即通入無菌空氣，以維持罐壓，然后開啟冷卻系統進行冷卻。

滅菌時間計算

分批滅菌時間包括加熱升溫、保溫和降溫冷卻三個階段，滅菌主要在保溫階段實現，但升溫和降溫階段也有一定貢獻。習慣上，保溫階段的時間為滅菌時間，主要計算滅菌時間和熱量。升溫是采用夾套、蛇管中通入蒸汽直接加熱，或在培養基中直接通入蒸汽加熱，或兩種方法并用，得以實現。在升溫階段，一般認為100℃以上才能起到滅菌作用，它對滅菌的貢獻占20％。保溫階段的貢獻占75％，降溫階段的貢獻只有5％。總體完成滅菌的周期約3－5小時。

根據微生物濃度和比死亡速率，通常以耐熱芽孢桿菌為對象，可以計算滅菌時間。

對于熱量計算，涉及所需蒸汽量。可用溫度、傳熱系數、培養基質量、比熱、換熱面積進行衡算。空罐滅菌的消耗蒸汽體積為罐體積的4－6倍。

操作過程

排放夾套或蛇行管中涼水，開啟排氣閥。由空氣管通入蒸汽，對培養基加熱。夾套通入蒸汽進行間接加熱。

在70℃左右時，從取樣管、放料管通入蒸汽。

在120℃時，罐壓1×105Pa，打開接種、補料、消泡、酸堿等管閥，排氣，并調節進汽和排氣量，進行保溫維持。料液下的管道都應通入蒸汽，料液上的管道都應排放汽。

保溫結束后，依次關閉排氣、進汽閥，罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫，使培養基降到所需溫度。

2.5.2.2 連續滅菌操作

培養基在發酵罐外經過一套滅菌設備連續的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發酵罐內的工藝過程，即連消。

特點：1）可采用高溫快速滅菌工藝，營養成分破壞的少；2）發酵罐利用率低；3）熱能利用合理，易于自動化控制；4）不適合粘度大或固形物含量高的培養基的滅菌；5）增加了連續滅菌設備及操作環節，增加染菌幾率。6）對壓力要求高，不小于0.45 MPa，一般為0.45-0.8 MPa。

加熱器兩種，塔式加熱器和噴射式加熱器。

塔式加熱器：一根多孔蒸汽導管和套管組成。培養基從下端進入，流速0.1m/s，蒸汽從塔頂進入，從小孔中噴出，與培養基激烈混合。塔高2－3m，培養基的停留時間20－30s。

噴射式加熱器：培養基從中間管進入，蒸汽從料管周圍的環隙進入，在噴嘴處快速混合。國內大多數企業采用。

保溫設備包括維持罐和管式維持器兩種。用保溫材料包裹，不直接通入蒸汽。

料液從維持罐上端連續通入到罐底，維持一定時間后，靠罐壓流入冷卻器。返混嚴重。

管式維持器：蛇管狀，培養基在管內處于湍流區，活塞流動狀態，返混為零。

降溫：噴淋式冷卻器為主，螺旋板式換熱器，板式換熱器，真空冷卻器等。

操作過程：

配料：配料罐，配制培養基。

預熱罐：定容和預加熱。70－90℃。

加熱器（連消塔）：培養基與蒸汽混合，快速升溫達到滅菌溫度，126－132℃。

維持罐：維持保溫培養基的滅菌時間。5－7分鐘。

冷卻管：從維持罐出來的料液經過冷卻水管冷卻。40－50℃。輸入滅菌底發酵罐中。

2.5.3 空氣過濾除菌

空氣的組成：氧氣、二氧化碳、氮氣的混合物，其中還有水汽及懸浮的塵埃，包括各種微粒、灰塵及微生物。

空氣嚴格除菌，達到無菌狀態，才能使用。工業中制備大量空氣的方法有加熱滅菌、靜電除菌。在發酵工業中，大多采用過濾介質（filter medium）除菌方法制備無菌空氣。

2.5.3.1 原理

微生物體積很小，空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5μm。過濾介質可以除去游離的微生物和附著在其他物質上的微生物。其原理在于空氣通過過濾介質時，顆粒在離心場產生沉降，同時慣性碰撞產生摩擦黏附，顆粒的布朗運動使微粒之間相互集聚成大顆粒，顆粒接觸介質表面，直接被截留。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好。慣性碰撞截留起主要作用，另外靜電引力也有一定作用。

膜過濾技術已得到發展，膜過濾器也用來空氣除菌，常用的濾膜有硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜等。其原理在于微生物和微粒（約0.5-20μm） 等大于濾膜的網眼直徑(0.3μm)，被直接截留于表面。另外沉降作用和靜電吸附對除去微粒和塵埃等也有一定貢獻。

2.5.3.2 發酵空氣的標準

連續一定流量的壓縮無菌空氣。空氣流量：VVM：單位時間（min）單位發酵液體積（m3）內通入的標準狀態下的空氣體積（m3），一般在0.1-2.0。壓強：壓力表顯示0.2-0.4 MPa，克服下游阻力。空氣質量：相對濕度小于70％；溫度比培養溫度高10－30℃；潔凈度100級，或失敗率10－3。

2.5.3.3 空氣預處理與設備

采風塔：在工廠的上風頭，高度一般在10m左右，設計流速8m/s。可建在空壓機房的屋頂上。

粗過濾器：安裝在空壓機吸入口前，前置過濾器。作用是截留空氣中較大的灰塵，保護壓縮機，減輕總過濾器的負擔，也能起到一定除菌作用。介質為泡沫塑料（平板式）或無紡布（折疊式），流速0.1-0.5 m/s。要求是阻力小，容灰量大。

空氣壓縮機：作用是提供空氣流動的動力。常用往復式、螺桿式、渦輪式空壓機。

空氣貯罐：消除壓縮空氣的脈動，用于往復式空壓機。螺桿和渦輪式提供均勻連續空氣可省去。設置在空壓站附近。

冷卻器：空氣壓縮機出口氣溫一般在120℃，必需冷卻。在潮濕季節，除濕。空氣冷卻器的傳熱系數為105W/(m2 ℃)。采用雙程或四程結構，兩級串聯使用。第一級循環水冷卻，第二級低溫水（9℃）冷卻。設置在發酵車間外。壓縮空氣每經過1m管道，溫度下降0.5-1.0℃。

2.5.3.4 油水分離與設備

氣液分離設備：除去空氣中油和水，保護過濾介質。旋風分離器和絲網除沫器兩類。

旋風分離器，利用離心沉降原理。結構簡單，阻力小，分離效率高。壓縮空氣的速度15－25m/s，切線方向進入旋風分離器，在環隙內做圓周運動，水滴或固體顆粒被甩向器壁，而收集。完全除去20μm以上離子，對10μm離子的分離效率為60－70％。

絲網除沫器：利用慣性攔截原理。對1μm以上的霧滴除去率98％。

空氣加熱設備：空氣相對濕度仍然為100％，需要降到70％以下，才能進入空氣過濾器。列管式換熱器，空氣走管程，蒸汽走殼程。套夾式加熱器，空氣走管程，蒸汽走夾套。

2.5.3.5 空氣過濾介質與設備

要求除菌效率高，耐受高溫高壓，不易被油水污染，阻力小，成本低，易更換。常用的介質有棉花、活性炭、玻璃棉、超細比例纖維紙、石棉濾板等。

絕對過濾器：介質孔徑小于被截留的微生物體積，如四氟乙烯、纖維素樹脂微孔濾膜。

深層過濾器：介質空隙對于被截留的微生物體積，但有一定厚度，靠靜電、擴散、慣性、攔截。棉花過濾器、超細玻璃纖維紙、石棉過濾、金屬燒結管等。

實驗室采用一級過濾器，生產規模設置二、三級過濾器，第一級為總過濾器，二、三級為分過濾器。

纖維及顆粒介質過濾器：圓筒形，直徑2.5－3m。孔徑10－15mm。空氣從下方進入，上方引出。常用介質棉花、玻璃纖維、活性炭等。空氣流速0.2-0.3m/s。可作為總過濾器。

過濾器的滅菌：通入蒸汽，0.2－0.4MPa，45分鐘。壓縮空氣吹干，備用。總過濾器每月滅菌一次。應該有備用過濾器，滅菌時交換使用。

紙過濾器：超細玻璃纖維紙為介質，孔徑1－1.5um，厚度0.25-0.4 mm，填充率14.8%。除菌效率很高，0.3μm粒子，99.99%。空氣流速0.2-1.5 m/s。阻力很小。可作為終端過濾器。

金屬燒結管過濾器：幾十至上百根金屬微孔過濾管安裝在不銹鋼殼體內組成。孔徑10－30μm，處理能力達100m3/min。特點：壽命長，耐高溫，阻力小，安裝維修方便。可作為終端過濾器。

微孔膜過濾器：不銹鋼中心柱，濾膜做成折疊型的過濾層，繞在中心柱上，外加耐熱的聚丙烯套。特點：體積小，處理量大，壓降小，除菌效率高，能除去0.01μm以上粒子。流速0.5-0.7m/s，壓降小于100Pa。一般前置空氣預過濾器、蒸汽過濾器，延長其使用壽命。膜材料有硼硅酸纖維，預過濾器，除去灰、垢；聚偏二氟乙烯，終端過濾器；聚四氟乙烯，終端過濾。

新型子彈狀膜過濾器：過濾膜是“皺褶膜”，體積小，阻力小，過濾面積大，膜易更換。棉花和活性炭填充時，體積大，吸油水能力強。超細玻璃纖維紙除菌效率高，但易被水油污染。新型過濾器將取代傳統過濾器。

2.5.3.6 空氣過濾除菌的工藝流程

為了獲得無菌空氣，一般采用三個主要工段。

（1）提高空氣的潔凈度：前過濾器可減少壓縮機活塞和氣缸的磨損，減少介質負荷。

（2）除去空氣中油和水：采用分級冷卻，一級冷卻采用30度左右的水使空氣冷卻到40－50℃，二級冷卻器采用9℃冷水或15－18℃地下水，使空氣冷卻到20－25℃。冷卻后，空氣濕度提高了100％，濕度處于露點以下，油和水凝結成油滴和水滴，在空氣貯藏罐內沉降大液滴。旋風分離器分離5μm以上的液滴。絲網除沫器分離5μm以下液滴。

（3）獲得無菌空氣：分離油水后的空氣濕度仍然達100％，溫度稍下降，就會產生水滴，使介質吸潮。加熱提高空氣溫度，降低濕度（60％以下）。這樣空氣溫度達30－35℃，經過總過濾器和分過濾器除菌后，得到符合要求的無菌空氣。

2.5.4 無菌檢查與雜菌控制

雜菌的檢測與控制是十分重要的，雜菌的污染將嚴重影響產量和質量，甚至倒罐。

雜菌檢測的主要方法為顯微鏡檢測和平板劃線檢測兩種，顯微鏡檢測方便快速及時，平板檢測需要過夜培養，時間較長。檢測的原則是每個工序或一定時間進行取樣檢測，確保下道工序無污染。

發酵污染雜菌的原因復雜，但歸結起來主要有種子污染、設備及其附件滲漏、培養基滅菌不徹底、空氣帶菌、技術管理不善等幾方面。

2.5.4.1 無菌試驗方法與染菌的判斷

肉湯培養法：用裝有酚紅肉湯的無菌試管取樣，放入37℃恒溫培養。

斜面培養法：空白無菌試管取樣，接種于斜面培養基，37℃培養。

種子罐和發酵罐每隔8小時取樣一次。

以酚紅肉湯反應和雙碟檢查為主，鏡檢為輔。連續3個時間的酚紅肉湯無菌樣發生顏色變化，或雙碟上連續3個時間樣品長出雜菌，即判斷為染菌。酚紅肉湯不明顯，要結合鏡檢。

2.5.4.2 培養基滅菌不徹底及其控制

培養基滅菌不徹底是常見的導致發酵過程被污染雜菌的原因。最主要原因是由于蒸汽壓力或用量不足、滅菌時間不夠引起的，滅菌時產生大量泡沫、有難溶固體顆粒或罐內污垢堆積也會直接影響了滅菌效果，另外設備制作或安裝不當，蒸汽不能到達，造成滅菌死角。

根據造成滅菌不徹底的原因，可采取相應的措施。保證滅菌所需的蒸汽壓力、用量和時間。為了防止產生大量泡沫，升溫時間不宜太快，要適當；含糖和含氮培養基可分開滅菌，進氣和排氣閥門開啟要緩慢。

2.5.4.3 空氣帶菌及其控制

空氣過濾器效能下降，除菌失敗，導致通入污染空氣。空氣除菌環節較多，每一個環節的失控就會導致滅菌失敗。包括管件穿孔與滲漏帶入雜菌和過濾介質松動、老化、吸潮等，使過濾除菌性能下降所致。

可通過定期檢查管件、更換過濾介質和加強檢修來解決。

2.5.4.4 設備及其附件滲漏引起的污染及其控制

發酵設備及其附件的滲漏是化學和電化學腐蝕、機械磨損共同作用引起的，一旦設備及其附件的滲漏，就會引起污染。冷凝蛇管和夾套的穿孔滲漏，會使冷卻水污染雜菌。閥門滲漏，外界的空氣或水會進入發酵罐，引起污染。

對于設備失修、滲漏引起雜菌污染，要建立并執行完善的管理制度、操作制度與規程，加強技術設備管理，定期檢修和維護發酵設備及各個環節，雜菌污染是可以杜絕的。一旦發現污染，要及時處理。

4.1 制藥動物細胞

4.1.1 動物細胞的結構與功能

4.1.1.1 動物細胞的結構與基礎代謝

動物細胞屬于真核細胞(eukaryotic cell )，其結構和成分更復雜，功能全面。在光學顯微鏡下，哺乳動物細胞由細胞膜(cell membrane)、細胞質(cytosol)和細胞核(nucleus)三部分組成，沒有細胞壁(cell wall)。線粒體（mitochodrium）、內質網(endoplasmic reticulum)、核糖體（ribosome）、高爾基體(Golgi body)、質體(plastid)、微粒體(microsome)、溶酶體(lysosome)、中心體（centrosome）等亞細胞器，都由一層或二層生物膜包裹并區域化，成為獨立的結構，行使各自的獨特功能。

細胞的各種代謝活動都在亞細胞分區內進行，各區域被細胞膜所分隔。細胞膜包裹細胞，使之與環境分開，維持細胞滲透壓和離子的交換。質膜是雙分子磷脂組成，與原核細胞相同。膜上有受體，動物細胞膜對大分子具有胞吞和胞吐作用。

懸浮培養的動物細胞，呈球形，直徑約7～20 μm，屬于單細胞培養。但與微生物的顯著不同，動物細胞沒有堅硬的細胞壁，培養中對滲透壓、剪切力、氣泡撞擊引起的損傷更敏感。

動物細胞的不同的代謝途徑及其相應的酶體系定位于特定的亞細胞區域(表)。區域之間通過胞內運輸（囊泡包裹）實現物質、信息和能量的流動，通過穿梭實現不同代謝途徑之間交換。

4.1.1.2 動物細胞培養的代謝特征

在動物細胞培養中，葡萄糖和谷氨酰氨是提供能量和合成代謝的前體。葡萄糖的限制可以通過增加谷氨酰氨的消耗得以補償，反之亦然。谷氨酰氨是動物細胞的氮源，在谷氨酰氨受限制時，可以通過增加其他氨基酸的消耗得以補償。

動物細胞吸收葡萄糖后，主要途徑有糖酵解（glycolytic pathway），把葡萄糖分解為丙酮酸，進一步被還原為乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養液中積累。另一條途徑為丙酮酸進入三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle, TCA循環)，徹底氧化產生CO2和水。還有一小部分（4％～8％）葡萄糖進入戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway, PPP），把葡萄糖轉化為4、5、7碳糖和還原力NADPH，5碳糖用于核酸合成。中間產物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，會產生大量的乳酸，對細胞有毒性。

動物細胞吸收谷氨酰氨后，進入氨基酸代謝，通過脫氨、轉氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。

大多數谷氨酰通過脫氨生成谷氨酸，并釋放氨離子。小部分谷氨酰胺通過轉氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體。

谷氨酰氨的轉氨作用，還可通過谷氨酸還原酶把谷氨酸轉化為中間產物α-酮戊二酸，α-酮戊二酸進入三羧酸循環，為細胞提供能量。所以谷氨酰氨在細胞能量代謝中具有重要作用。

谷氨酰氨與谷丙酮酸和草酰乙酸發生轉氨作用，生成丙氨酸和天門冬氨酸，丙氨酸可進入培養液并積累。

在快速生長的動物細胞培養體系，轉氨作用是主要的代謝途徑。谷氨酰胺在脫氨酶的催化下，脫氨產生的氨，對細胞有毒性。

不同的培養條件，葡萄糖和谷氨酰胺代謝是在丙酮酸上有重疊，在正常細胞系中，丙酮酸羧化產生草酰乙酸，而草酰乙酸來源于谷氨酰氨。

在連續細胞系中，沒有這種流動。能量是以ATP和NADPH的形式提供，來源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二者對各個代謝途徑的貢獻和所起的作用不同。

常用流加葡萄糖或谷氨酰氨，來控制整個代謝過程，避免有毒廢物的積累。

4.1.1.3 蛋白質糖基化與分泌表達

細胞核內基因轉錄形成RNA，經過剪切和加工，形成mRNA，運送到與細胞核膜緊密相連的內質網膜體系上。粗糙內質網上有大量的核糖體存在，翻譯合成蛋白質。粗糙內質網腔內有與膜和分泌性蛋白質翻譯后的加工（糖基化）、蛋白質的水解酶等，具有加工剪切、磷酸化等功能，內質網合成各種糖類。蛋白質的糖基化無需模板指導，因此糖蛋白(glycoprotein)的寡糖結構容易發生變化。寡糖基是以共價鍵與蛋白質的氮或氧原子結合的，分別稱為N-糖基化和O-糖基化（glycosylation）。

糖基化過程與產物的分泌緊密相連，發生在內質網和高爾基體上，有大量的糖基轉移酶和糖苷酶控制。對于分泌型蛋白，分泌泡與細胞膜融合，釋放到胞外，完成了蛋白質的分泌表達。

盡管哺乳動物細胞具有胞內的糖基化裝置，但不同細胞系，糖基化特征不同。因此要根據糖基化的結構，選擇適宜的細胞系。

4.1.2 制藥動物細胞的種類

4.1.2.1 有限細胞系

根據體外培養細胞的整個生命過程，可把細胞分為原代細胞（primary cell）和傳代細胞(passage cell)。

從體內取出的組織細胞進行體外接種培養稱為原（初）代培養(Primary culture)，原代培養的細胞為原代細胞，它生長分裂并不旺盛，與體內細胞相似，適合于藥物檢測實驗。生產中有些產品仍沿用原代細胞，如雞胚細胞、兔或鼠腎細胞、淋巴細胞。

原代細胞轉接后培養的細胞為傳代細胞。傳代后，細胞分裂增殖旺盛，能保持一致的二倍體核型，所以又稱為二倍體細胞系(diploid cell)。

根據細胞的傳代次數和壽命，可分為有限細胞系（finite cell line）和無限細胞系（infinite cell line）或連續細胞系（continuous cell line）。正常細胞經過多次傳代后，一般可連續培養30～50代，就會逐漸失去增殖能力，也就是說它們只能生長有限的時間，經過若干傳代培養后將老化死亡，把這類細胞稱為有限細胞系。大多數傳代細胞都是有限細胞系，如人細胞最高培養次數為50～60代。二倍體傳代細胞的增殖能力有限，所以也稱為有限細胞系。如WI-38、MRC-5、2BS等用于生產。

4.1.2.2 無限細胞系

當細胞經過自然或人為的因素轉化為異倍體后，才能變為無限細胞系或連續細胞系。如腫瘤細胞就是自發形成的永久細胞系（immortal cell line），沒有分裂次數的限制。物理（紫外線、X射線等）、化學（致癌因子誘變劑等）或生物因素（病毒感染、癌基因和突變基因轉染等）也能獲得此類細胞系，此時細胞的壽命是無限的，生長不受細胞密度的影響，也不具有接觸抑制現象和細胞形狀不規則、出現異常染色體的特性，非常適合于制藥工業生產。

正常細胞染色體斷裂形成異倍體，失去了正常細胞的特點，具有無限增殖能力，這就是異倍體連續細胞系。它對培養條件和生長因子等要求低，倍增時間短，是理想的藥物生產細胞系。

如果采用基因工程技術對宿主細胞的遺傳物質進行了修飾，獲得具有獨特性狀的遺傳學穩定的細胞，就是工程細胞系（engineered cell line）。如把正常傳代細胞異倍體化，或融合或重組都可形成工程細胞系。

4.1.3 常見生產用動物細胞系

藥物生產應用的主要細胞系是C127、CHO、BHK，以CHO為主，占44％。抗體生產全部用雜交瘤和CHO細胞系。

4.1.3.1 人源細胞株系

Namalwa：從淋巴瘤病人（Homo sapiens，human)中分離獲得的類淋巴母細胞，含有部分Epstein-Barr病毒基因，但不表達完整的EB病毒。非整體核型，2n=12～14，單X染色體，無Y染色體。表達IgM懸浮生長。外源基因的表達水平較高，可用無血清培養基高密度培養。已成功地表達了rhEPO、rhG-CSF、tPA等，已用于大規模生產干擾素，并批準上市。

WI-38:美國Wistar研究所（Wistar Institute，WI）從正常人（Homo sapiens，human）胚肺組織分離獲得的二倍體（diploid）成纖維（fibroblast）細胞系，貼附型生長，2n=46。細胞倍增時間24小時，壽命50代，第一個被用于制備疫苗。MRC-5也是正常二倍體成纖維細胞系，但生長較WI-38快，壽命為42～46代，也用于制備疫苗。

4.1.3.2 哺乳動物細胞株系

CHO細胞：從中國倉鼠（Cricetulus griseus）卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）中分離的上皮樣（epithelial）細胞系，貼附型生長體性，是目前使用最為普遍和成熟的宿主細胞。對水泡性口炎和Getah病毒敏感。核型為亞二倍體，2n=22。分泌表達外源蛋白，而內源蛋白分泌很少。屬于貼壁生長細胞，可進行懸浮培養，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。蛋白質翻譯后的修飾準確，表達產物的結構、性質和生物活性接近天然。有多個衍生突變株應用于藥物的生產，培養時需要添加脯氨酸。采用二氫葉酸還原酶（DHFR）的缺陷株表達的藥物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ等已投放市場。在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下，增加外源基因的拷貝數，提高蛋白的表達水平，使外源基因高效表達。

BHK：從幼倉鼠的腎臟（baby hamster kidney, BHK）中分離的成纖維樣細胞，非整倍體，2n=44。用于增殖病毒，制備疫苗和重組蛋白。兩種重組凝血因子Ⅷ，Bayer的Kogenate FS、Aventis Behring的Helixate分別于1989和1994被FDA獲準上市，1999年FDA批準Novo Nordisk的重組凝血因子VIIa（NovoSeven）上市，用于治療血友病。

C127：從小鼠（Mus musculus，mouse）乳腺（mammary gland）腫瘤中分離獲得的上皮樣細胞，貼附型生長。被牛乳頭病毒（bovine polyoma virus）DNA載體轉染后，細胞形態發生明顯變化。C127：LT細胞系，生長密度高，表達組成型大T抗原，可以識別和篩選。C127I細胞適合于牛乳頭病毒DNA載體的轉化。C127細胞系已表達多種外源基因，Serono公司生產rhGH（Saizen, Zorbtive）于1996年被FDA已被批準進入市場。

雜交瘤細胞：從小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞中分離獲得雜交瘤細胞系，有SP2/O、J558L和NSO等。能在無血清培養基中高密度懸浮生長，容易轉染和生長，能進行糖基化等加工修飾，大量分泌和高效表達。不同的啟動子在骨髓瘤細胞中都能發揮很好的作用。SP2/O－Ag14不分泌免疫球蛋白抗體鏈，可用8-氮鳥嘌呤篩選，用于抗體的制備。

Vero：從成年非洲綠猴（Cercopithecus aethiops，African green monkey)腎中分離獲得的貼壁依賴性成纖維細胞，多倍體核型，66%細胞的2n=60，為連續細胞系。Vero E6最為常用，可增殖多種病毒，如脊髓灰質炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產疫苗，被批準用于人體。也可作為轉染的宿主細胞，用于表達外源基因的蛋白質藥物和病毒的檢測。

4.1.3.3 昆蟲細胞株系

Sf21：是從秋黏蟲（Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢細胞中分離得到的，細胞較大，容易放大，高效表達外源基因。

Sf-9：是從秋黏蟲的卵巢細胞（SF21）中分離得到，最常用的昆蟲表達細胞。倍增時間為18～24小時，能高效表達外源基因。

TN-5B1-4：是從粉紋夜蛾（Trichoplusia ni，TN）卵細胞勻漿中分離得到的，無血清培養，快速倍增。分泌表達重組蛋白的能力比SF9細胞系高20多倍，能適應懸浮培養。

4.1.3.5 雞胚細胞

生產疫苗。

4.2 哺乳動物細胞生產特征

4.2.1 對培養條件要求嚴

動物無細胞壁保護，細胞膜直接接觸外界。物理化學因素如溫度、滲透壓、pH、離子濃度、剪切力等耐受力很弱，容易受傷害。與細菌和植物細胞相比，動物細胞培養條件要求苛刻，周圍環境十分敏感。

4.2.1.1 溫度

不同種類的動物細胞對溫度的要求是不同的，變溫動物對溫度要求沒有恒溫動物嚴格。哺乳動物細胞最佳培養溫度為37℃，雞細胞為39℃～40℃，而昆蟲類細胞為25℃～28℃。在培養過程中，根據細胞種類選擇確定適宜的培養溫度。

哺乳動物細胞的耐受溫度范圍較窄，在35℃～37℃內能正常進行代謝和生長，超出范圍會引起細胞傷害甚至死亡。在39℃～40℃培養基1小時，細胞受傷，但能恢復。在41℃～42℃，受傷嚴重，部分可恢復。43℃以上，大多數死亡。細胞對低溫的耐受性比高溫要強，低溫抑制生長，但無傷害作用。

4.2.1.2 氧氣

動物細胞生長必須有氧氣，大多數細胞缺氧時不能生存。離體培養的氣體含有5％CO2和95％空氣，其中氧濃度為21％。有時充以N2氣稀釋O2濃度。O2濃度在60%以上為高氧環境，對細胞毒性較大，往往抑制生長和增殖，出現染色體異常等現象。

4.2.1.3 pH值

絕大多數低于6.8或超過7.6會對細胞產生嚴重影響動物細胞，甚至使細胞死亡。機體細胞的pH范圍為6～8，而且在血液和體液中，變化范圍很小。人體血液pH比較恒定，維持在7.36～7.44。pH低于7.05會發生酸中毒，高于7.45發生堿中毒。血液中有四個緩沖體系，碳酸鹽緩沖體系、磷酸鹽緩沖體系、血紅蛋白緩沖液體系、血漿蛋白緩沖體系。其中碳酸鹽緩沖體系數量最多、作用最大。H2CO3解離，提供H＋，與OH－結合，中和堿。NaHCO3提供HCO3－，接受H＋，中和酸。

4.2.1.4 滲透壓

正常血漿滲透壓（Osmotic pressure）范圍為280～310 mOsm/kg（690～859kPa），主要是無機鹽Na＋、K＋、Cl－、HCO3－等構成血漿晶體滲透壓起作用，而蛋白質構成膠體滲透壓較小，不超過1.5 mOsm/kg。高于310 mOsm/kg的溶液為高滲溶液，低于280mOsm/kg為低滲透壓溶液。動物細胞對滲透壓有較強的耐受性，常用增減NaCl的濃度調整滲透壓，每增加1mg/ml NaCl，滲透壓增加32 mOsm/kg。離體培養細胞的滲透壓應控制為等滲透溶液。

4.2.2 對培養基的要求高

需要容易利用、豐富的相對低分子量的營養物，包括12中必需氨基酸，8種以上維生素，多種無機鹽和微量元素，多種附加成分。能源：單糖，葡萄糖，谷氨酰氨。氮源：氨基酸單體化合物。

4.2.3 目標產物的特征

在動物細胞內，表達的蛋白質能正確加工、修飾并折疊形成具有生物活性的功能分子，接近或類似天然產物，可克服原核表達對產物質量的不利影響。完善的翻譯后蛋白質修飾功能，產品與天然的產物一致，裝配折疊形成精確的三維結構，適于臨床使用。動物細胞表達產物分泌到培養液，使分離純化相對簡單。

動物細胞表達系統的不足是細胞生長緩慢，生產效率較低，產量落后于其他表達系統。連續細胞系增加了生長和代謝速率，但同時導致了副產物的增加。使用血清，費用較高，而且有潛在的血源性污染危險（逆轉錄病毒）致病因子、免疫原性存在。不同細胞系的表達水平差異較大，因此，表達載體的改進和宿主細胞的改造是動物細胞表達系統的研發重要內容。

4.3 動物細胞培養基的制備

4.3.1 培養基的成分

由于動物細胞對培養基的要求高，不同細胞系的要求也不盡相同，要盡可能提供與體內生活條件接近的培養環境。主要組成成分包括糖類、必需氨基酸、維生素、無機鹽類、生長類因子及激素、結合蛋白質、貼附與伸展因子及其它附加成分等。

4.3.1.1 糖類

糖類提供細胞生長的碳源和能源，分解后釋放出能量ATP，主要是葡萄糖。不同細胞對葡萄糖利用相似，在無氧條件下還產生乳酸等有機酸。

4.3.1.2 氨基酸

谷氨酰胺是體外動物細胞培養的重要碳源和能源。21種氨基酸中至少12種是必需氨基酸，包括精氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)、組氨酸（His）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、蘇氨酸（Thr）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）等。這些氨基酸必須在培養基中添加，才能滿足細胞的生長。

4.3.1.3 維生素

維生素是一類微量的小分子有機生物活性物質，既不是細胞的物質基礎，也不是能量物質，對代謝和生長起調節和控制作用。水溶性維生素包括B族維生素和維生素C，脂溶性維生素包括維生素A、D、E、K四種。

4.3.1.4 無機鹽類

胞內的無機鹽是細胞代謝所需酶的輔基，同時保持細胞的滲透壓和緩沖pH的變化。胞外無機鹽對維持正常生長環境很重要。Na＋是重要的胞外陽離子，Na＋和Cl－參與生理電活動，具有維持水平衡、保持滲透壓和酸堿平衡的作用。離體培養為細胞提供足夠的Na和Cl離子是基本條件，一般為生理鹽水的離子濃度（0.9% NaCl）。

Ca2＋、Mg2＋是細胞的構成成分，對細胞間的互黏穩定起重要作用。碳酸鹽緩沖液是重要的體內緩沖體系，與K＋、Cl－等在維持酸堿平衡具有重要作用。微量元素有Fe、Zn、Cu、Mn、Co、Mo、F、Se、Cr、I等是酶的組成成分，調節酶活性。

4.3.1.5 生長類因子及激素

胰島素是最常用的激素，使用濃度為1～10μg/ml，對細胞的生長有刺激作用。其它激素有促卵泡激素、甲狀腺素、乳激素、生育酚等。細胞因子有表皮生長因子、成纖維細胞生長因子和神經細胞生長因子，根據不同細胞添加。為了細胞的貼壁生長，必需添加貼附因子，如纖維結合蛋白、膠原等。

脂類化合物對動物細胞培養是必需的，實際中類脂及其前體和血清常平行使用。添加的蛋白質試劑主要有鐵傳遞蛋白，起離子載體的作用。有時用無機鐵鹽，如硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵等代替鐵傳遞蛋白。

4.3.2 培養基的種類

4.3.2.1 天然培養基

天然培養基是最早期人們采用的細胞培養基，直接取自于動物組織提取液或體液作為培養基，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。營養價值高，但成分復雜，而且不穩定，來源也受到限制，不宜大量培養和生產使用。水解乳蛋白和膠原是兩種較好的天然培養基，富含氨基酸。

血清是天然培養基中最有效和最常用的培養基，有些成分功能明確，另外一些成分功能不明確。血清的來源有胎牛血清、新生牛或成牛血清、馬血清、雞血清、羊血清及人血清，最廣泛應用的為胎牛血清和新生牛血清。血清和水解酪蛋白應用于許多細胞系和原代及傳代細胞培養。

4.3.2.2 合成培養基

合成培養基是用化學成分明確的試劑配制的培養基，組分穩定，可大量供應。合成培養基發展至今已有幾十種，大部分已商品化。由于細胞種類和培養條件不同，適宜的合成培養基也不同，在動物細胞培養中最常用培養基7－8種，如BME、MEM、DMEM、IMEM、HAM F12、PRMI1640、M199等。

由于天然培養基的一些成分仍然不清楚，不能用已知的化學成分代替，因此必需在合成培養基中添加5％~10％的小牛血清。在雜交瘤培養中，要求更嚴格，添加濃度更高，一般為10％～20％的胎牛血清。血清的加入對培養非常有效，但對培養產物的分離純化和檢測會組成一定的不便。

4.3.2.3 無血清培養基

無血清培養基（serum free medium, SFM）是全部用已知成分組配的不加血清的合成培養基，通常在含有細胞所需營養和貼壁因子的基礎培養基中加入適宜的促細胞生長因子，保證細胞良好生長，是最適合于制藥生產的培養基。它提高了培養的質量，避免了使用血清帶來的麻煩：血清中某些細胞毒性成分，血清中存在病毒、真菌、支原體等微生物污染的危險，血清中蛋白對產物蛋白測定的干擾。產品純化容易，組分穩定，可大量配制。已有各種無血清培養基上市。

一些合成培養液可以作為無血清培養液的基礎，如CMRL 1060、TC199、IMDM、McCoy 5a、Ham’s F10和F12。已有其他商品化的無血清培養液，如淋巴細胞無血清培養基、內皮細胞無血清培養基、雜交瘤細胞無血清培養基、巨噬細胞無血清培養基等。

無血清培養基通常添加生長附加成分，如激素與生長因子、低分子營養成分和轉鐵蛋白等，主要包括胰島素、孕酮、硒酸鈉、腐胺、轉鐵蛋白。對于大規模生產用的無血清培養基，往往成分不完全清楚，但簡單而且低成本。

4.3.3 動物細胞培養基的控制

4.3.3.1 培養用水質

細胞培養水質最低要求電導率在1×106 Ω cm以上。水存放時間不宜超過2周。對于制藥，必需使用純凈水配制培養基，普通水必需除去各類元素、有毒或有害物質及微生物，還必需除熱源，達到純凈水標準。

4.3.3.2 緩沖液

緩沖液(buffer solution)為弱酸與弱酸鹽或弱堿與弱堿鹽組成的，pH恒定但不干擾培養。常用的碳酸氫鈉/碳酸（NaHCO3/H2CO3）、磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉(Na2HPO4/NaH2PO4)緩沖體系，調節二者的比例，配制成不同pH緩沖液。一般要求體外培養緩沖液pH為7.2～7.4，滿足動物細胞生長的最適pH。

最廣泛使用的緩沖液為鹽離子緩沖液NaHCO3/H2CO3，其次為Na2HPO4/NaH2PO4。碳酸鹽緩沖液除了直接的緩沖作用外，還有間接作用，碳酸生成揮發性CO2后很快逸出。細胞呼吸產生的CO2與水形成碳酸，在培養液中的任何堿都被中和，生產相應碳酸氫鹽。碳酸氫鈉在37℃時的緩沖能力為pH7.0～7.5，如果培養液pH超出此范圍，就不能維持pH穩定性。而CO2的逸出，增加培養液的堿性。因此，在開瓶培養時，需要供應5％～10％ CO2和95％～90％空氣，以平衡培養液中的CO2。

4.3.3.3 生理鹽水與平衡鹽溶液

緩沖液或緩沖鹽溶液多用于配制一些與活細胞經常接觸的溶液或培養后進一步處理細胞的溶液，如培養物的洗滌液等。對于直接接觸、長期培養的培養液，常用生理鹽水和平衡鹽溶液，是滲透壓與胞漿滲透壓平衡的溶液。

最簡單的生理鹽水為0.9% NaCl溶液，為等滲溶液。現在有各種不同成分的生理鹽水，分別加入pH緩沖劑與指示劑、葡萄糖等，形成了平衡鹽溶液。

平衡鹽溶液（balanced saline solution, BSS）是集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲能力、營養供給為一體，具有多種功能和作用。在平衡鹽溶液中，加少量酚紅（phenol red），作為酸堿指示劑。溶液變酸時呈黃色，變堿時呈紫紅色，中性時為櫻桃紅色，肉眼可檢測pH的變化。

4.4 動物細胞的培養技術

4.4.1 細胞生長的基質依賴性

4.4.1.1 細胞對基質的依賴性

根據細胞的生長特性和對基質的依賴性，可分為貼壁依賴性細胞（anchorage-dependent cell）和非貼壁依賴性細胞（anchorage-independent cell）。

貼壁依賴性細胞的生長需要適量帶電荷的固體或半固體支持表面，細胞自身分泌或人為在培養基中加入貼附因子(attachment factor)，使細胞依附在支持物表面，才能生長和增殖，大多數動物細胞都屬于此類，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞。

接觸抑制性是當細胞長滿整個培養表面后，就不再生長了，但仍然能存活一段時間。

非貼壁依賴性細胞的生長不依賴于固體支持物表面，可在培養液中懸浮生長，所以也被稱為懸浮細胞。血液、淋巴細胞、腫瘤細胞（包括雜交瘤細胞）和某些轉化細胞屬于此類。有些細胞對固體支持物的依賴性不嚴格，可以貼壁生長，但在一定條件下，也可以懸浮生長。如CHO細胞、小鼠L929細胞、BHK細胞等。

4.4.1.2 生長基質

貼附細胞生長需要一個支持介質，培養器皿表面的材質不適合，因此人們采用在培養液中添加或在器皿表面覆蓋生長基質，幫助細胞的貼附和生長。把改變生長表面特性，促進細胞貼附的物質稱為生長基質（growth substratum）。生長基質一般為胞外基質成分，這里主要介紹多聚賴氨酸、纖維連接蛋白、膠原、層黏蛋白、韌黏素等，其他載體材料見相關節。

多聚賴氨酸（poly-lysine）是合成的賴氨酸多聚體，分子量為7～30 ku的多聚賴氨酸可作為細胞生長基質。纖維連接蛋白（fibronectin）是細胞表面與血清漿中的大蛋白分子，具有維持細胞結構、促進貼附功能。層黏蛋白（laminin）為胞外基質中分子量900 ku的非膠原性糖蛋白，影響細胞的貼附和運動，調節細胞生長和分化。韌黏素（tenascins）是六聚體糖蛋白，分子量190～230 ku，具有促進腫瘤細胞、成纖維細胞和內皮細胞貼附的功能。層粘蛋白（vitronectin）是多聚體糖蛋白，分子量65～75 ku，具有促進細胞、血小板的黏附、激活補體和纖溶酶原活性等功能。

生長基質已有商業化產品，用PBS或BBS配成10倍貯存液，在37℃下包被，靜置2～4小時或室溫過夜，對器皿表面進行包被，然后無菌生理鹽水洗滌后使用。有些還可以直接加入培養液。

4.4.2 動物細胞系的獲得與保存

4.4.2.1 原代細胞培養

目前用于制藥的動物細胞有4類，即原代細胞系、二倍體細胞系、異倍體細胞系和融合的或重組的工程細胞系。

原代細胞系是直接用動物組織或器官，經過粉碎、消化而獲得的細胞懸浮液。用1g組織獲得的真正能滿足生產的細胞只是一少部分，因此用原代細胞系生產藥物需要大量的動物。

培養原代細胞需要自己制備，基本過程如下：處死動物后，在無菌條件下，取出組織并破碎，加入Hanks緩沖液，洗滌，低速離心，棄上清。用酶于37℃消化，輕搖，把組織分散成單細胞。用緩沖液洗滌，如果有大塊組織，再過濾。加入培養液，制成一定濃度的細胞懸浮液，細胞計數，檢查消化是否充分和完全。接種到培養基，進行培養。所用消化酶一般為胰蛋白或膠原酶，前者用于消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝、腎及傳代細胞等，時間30～60分鐘；后者適宜于纖維組織、上皮組織、癌組織等，常用BSS和含血清的培養基配成0.1～0.3 mg/ml的工作濃度，消化時間長根據具體情況而定，數小時至過夜。用于消化組織的酶還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等，可根據具體情況使用。

4.4.2.2 傳代細胞培養

二倍體細胞系是原代細胞經過傳代、篩選、克隆等從多種細胞中純化并具一定特征的細胞系。是典型的正常二倍體細胞，有限生長，無致瘤性，一般從動物胚胎組織中獲取。曾經廣泛應用，但不是理想的生產細胞系。

傳代是指對長滿器皿表面的細胞進行分離，接種到新的培養基上，進行新一輪培養。剛剛全部匯合的細胞是傳代的理想時期，過早產量低，過晚細胞健康狀態不佳，因此要掌握好最佳時期很重要。基本過程與原代細胞分離和培養相同，用30～50倍體積的0.25％胰蛋白酶和EDTA對細胞塊消化，消化后再培養。要注意消化程度，細胞對酶的反應不同，有的敏感，掌握好適宜的消化時間和方法，不要過度，獲得細胞濃度均勻，生長速度一致的傳代細胞。也可以用微囊載體進行傳代培養。

4.4.2.3. 細胞系的保存

一旦獲得了穩定的有一定特征的細胞系，無論傳代細胞系還是工程細胞系，就要建立細胞庫，進行長期保存。根據藥品生產的有關規定，必須建立原始細胞庫和生產用細胞庫或工作細胞庫。動物細胞系常用低溫冷凍方法進行保存。用冷凍保護液（含10％血清的培養液，附加10％甘油或7.5%～10%二甲基亞砜）將細胞預冷，稀釋成2×106～5×106細胞/ml。按1ml/安瓿瓶分裝，火焰下封口。放入慢凍機內，以1℃/min速度緩慢冷凍，至－25℃。如果長期保存，在液氮中聚苯乙醛制成的塞子控制冷卻，小心操作，避免凍傷。冷凍好的細胞放入CO2低溫冰柜或液氮中，溫度為－150～－190℃，細胞的全部活動幾乎處于停止狀態。

如果要復蘇細胞，將冷凍細胞取出，立即在37℃水浴中，快速融化。在保護劑存在下，慢凍快融是保存復蘇細胞的要領。融化后的細胞可用于進一步實驗。

4.4.3 大規模培養方法

根據動物細胞的生長特點，只能采用懸浮培養、貼壁培養、固定化培養三種主要方法進行大規模培養。

4.4.3.1 單層貼壁培養

單層貼壁培養（monolayer anchoraged-dependent culture）是指把細胞貼附于一定的固體支持表面上進行的單層培養方法。由于大多數動物細胞屬于貼壁依賴性，貼壁培養是動物細胞培養的一種重要方法。接種后，細胞經過吸附、接觸而貼附于基質表面，然后進行生長、分裂繁殖，很快進入對數期。一般數天就長滿整個表面，形成致密的單層細胞。最后，貼壁培養的細胞會形成二種形態，成纖維樣型細胞（fibroblast-like cell type）和上皮樣型細胞(epithilium-like cell type)。

單層貼壁培養必須根據細胞數目和培養液的體積，增加基質表面積。實驗室研究培養常用多孔平板（multiwell plate,如96孔、6孔等）、培養瓶（flask,如25ml、100ml等），進行靜止培養(static culture)。動物細胞大規模培養常用容器主要有轉瓶（roller bottle）或轉管(roller tube)、玻璃珠、微載體和中空纖維等。

細胞黏附在固體表面主要力是靜電引力和范德華力，因為動物細胞在生理狀態下帶負電，貼壁培養的固體表面要求具有正電荷和高度表面活性。適宜的電荷密度是黏附和貼壁的關鍵，電荷密度低，不能有效黏附，電荷密度高則會對細胞產生毒性。

轉瓶是早期培養所采用，現在仍用于疫苗等生產。轉瓶結構簡單，投資少，經濟實用，可做成支架，大量培養，收獲細胞或培養液方便，重復性好，容易放大。非貼壁細胞處于懸浮狀態，而貼壁細胞則在瓶內壁上貼附生長形成單層細胞。主要優點是比表面積增加，處于衡態轉動，增加氣體交換。但轉瓶的勞動強度大，占用空間體積大，產量低，不易控制和監測培養環境變化。轉瓶的空間變化較大，在500～1800 cm2之間，塑料瓶一般一次性使用，而玻璃瓶可重復使用。有時細胞在貼壁之前會發生集聚，可將轉速進一步降低到2～5轉/小時。選擇適宜的血清或表面包被聚賴氨酸等，能克服集聚現象。

貼壁培養的優點是容易更換培養液，在灌注培養時，能達到高細胞密度；有利于產物的分泌表達，可改變培養液與細胞的比例。其缺點是操作較煩雜，細胞生長的檢測受到一定限制，培養條件難以均一，傳質和傳氧差，放大培養是瓶頸。

4.4.3.2 懸浮培養

懸浮培養（Suspension culture）是指細胞在反應器內游離懸浮生長的培養過程,主要對于非貼壁依賴性細胞，如雜交瘤細胞等。動物細胞懸浮培養是在微生物發酵的基礎上發展而來的，經常借鑒發酵理論和經驗，但有自身的特點，由于動物細胞沒有細胞壁，不能耐受劇烈的攪拌和通氣剪切，對環境適應性差。在培養過程中與微生物發酵培養不同，在懸浮培養中要注意發揮動物細胞的特性。常用的反應器有通氣式攪拌混合氣升式生物反應器。方法的優點是操作簡單，培養條件相對均一，傳質和傳氧較好，容易放大培養。細胞體積小，密度低，培養病毒易失去標記而降低免疫能力。

4.4.3.3 固定化培養

固定化培養（immobilization culture）是將動物細胞包埋在微載體內或膠囊內，即細胞固定化后，進行懸浮培養。適宜于貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞的培養。具有細胞密度高、提高了抗剪切力和污染能力等優點，是生產首選方法。細胞固定化是在酶固定化基礎上發展起來的，固定化的方法有多種，對于特定情況，必須合理選擇。

吸附法(adsorption method)是通過物理吸附使細胞貼附在固體載體表面的一種固定化方法，如微載體培養和中空纖維培養等。雖然吸附法的操作過程簡單，但由于相互作用弱，細胞容易從載體上脫落。

包埋法(entrapment method)是將細胞包埋在載體內部的一種固定化方法，分為網格型和微囊型兩種。網格型的載體為高分子凝膠細網格，而微囊型的載體為高分子半透膜，直徑為幾至幾百微米，比網格載體小得多。包埋細胞的高分子材料有人工合成的聚合物、瓊脂糖凝膠和血纖維蛋白等。包埋細胞的材料可以是人工合成的高分子聚合物、多糖和蛋白質類，最常使用的是海藻酸鹽包埋非貼壁細胞和膠原包埋貼壁細胞。包埋的機理是通過物理作用而實現的，如1％～2.5％瓊脂糖在高溫加熱下融化，低于45℃～37℃凝固，與細胞混合，分散在石蠟油中，降低至10℃，得到0.1～0.3 mm微球。海藻酸鈉為液體，與細胞混合后，滴到氯化鈣溶液中，鈣的介入凝固，形成1 mm微球。凝血酶的加入可使血纖維蛋白對細胞的包埋。

4.4.3.4 微囊法培養

微囊法（microencapsulation method）是用親水半透膜把細胞包埋在微囊中的一種固定化方法。使用較多的是多聚賴氨酸/海藻酸固定細胞。凝膠載體的表面被長鏈氨基酸的聚合物如多聚賴氨酸覆蓋形成一層堅韌多孔可透薄膜，再使凝膠載體液化，便可制成微囊。雜交瘤細胞與海藻酸鈉溶液混合，經微囊發生器，微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，再用檸檬酸去鈣離子，球內海藻酸鈉成液態，細胞在微囊內懸浮。微囊形成一種微環境，降低了剪切力，細胞生長良好，實現高密度培養。微囊化固定培養工藝在單克隆抗體的生產中獲得成功，使抗體截留在膜內，血清中的蛋白質被排出在膜外，產物濃度和純度較高，培養結束后，收獲微囊，破微囊后，純化抗體，純化工藝簡單，應用前景廣。

Van Wezel于1967年開發了DEAE-Sephadex A-50的微載體系統培養貼壁細胞，細胞貼附于微載體上進行伸展和增殖，再懸浮于培養液中。微載體（microcarrier）培養兼具有貼壁和懸浮培養的雙重優點，有很大的比表面積，供單層細胞貼附和增殖，懸浮微球（microbead）使細胞生長的環境均一，能很好檢測和控制。培養基利用率高，重復性好，減少了勞動強度，容易放大，于20世紀80年代正式用于工業化生產干擾素、疫苗和尿激酶原等。以后，人們又研發了多孔微載體或多孔微球，極大的增加了比表面積，如Cytodex-1的比表面積達6000cm2/g，多孔微球cytopore的比表面積達2.8 m2/g。商品化的微球基質是玻璃、葡聚糖（dextran）、纖維素、塑料和明膠等，帶電基團為DEAE等。

微載體的直徑約60～250μm，但對于動物細胞培養經常控制在100～200μm之內。理想的微載體應該具備以下性能：質地柔軟，微球間的摩擦輕；耐高溫120℃，可高壓滅菌；透明性，可直接在顯微鏡下觀察細胞生長情況；細胞相容性，利于細胞貼附和生長；無毒性和惰性，對細胞本身無毒害作用，也不產生有害物質，不吸附培養基的成分；比重較低，為1.02～1.05 g/ml，低速（40～50 r/min）即懸浮，靜止即沉降，便于換液和收獲；微粒大小均勻，可回收重復使用。

4.5 動物細胞培養過程的檢測與工藝控制

有些參數的檢測與工程菌發酵相似，這里主要對不同之處進行闡述。

4.5.1 細胞活性與形態檢測

培養細胞要先制成懸浮液，計數后，再按一定濃度接種培養。一般用血球計數板對細胞在顯微鏡下進行計數，在細胞計數的同時，還必須檢查細胞的存活性，才能準確計算出相應的活細胞濃度。組織化學染色法是常用的檢測細胞活性的方法，可對細胞進行臺盼藍活體染色，死細胞染成藍色，而活細胞不著色。其它色素如苯胺黑、結晶紫等染色測定細胞活性。細胞形態的觀察也是在顯微鏡下進行的，活力良好的細胞，輪廓不清，透明度大，反之，活力低的細胞，輪廓可見，細胞質中出現空泡、脂質體和其它顆粒，細胞形態不規則，失去原有的特性，如上皮細胞變成纖維細胞。

在生長過程中，每隔幾天要對細胞進行檢查，內容包括是否污染、形態變化、活性變化等。動物細胞培養中污染的主要來源是培養基包括血清和培養用液，操作不慎帶入空氣中的微生物也是常見的污染來源。在發生霉菌污染時，會出現大的菌落，肉眼可見；但對于細菌污染，只有在嚴重情況下才會引起培養基混濁。因此常用肉湯培養基于37℃恒溫培養，檢查是否有細菌污染。類胸膜肺炎生物體（Pleuropneumonialike organism, PPLO）的污染也較常見。由于PPLO只有0.25～1 μm，無細胞壁，污染后，細胞仍能生長，甚至無明顯變化，因此常常不易發覺。支原體的污染源不清楚。支原體（mycoplasmas）污染后，有時使細胞發生不同程度病變，導致培養失敗，甚至可造成嚴重后果。支原體分解主要營養物質，干擾某些病毒生長；促進二倍體細胞老化。用污染細胞制備血清抗原和免疫血清時將產生混亂。對于病毒制劑，由于含有支原體抗原，使之不能使用。而且支原體與病毒可能被混淆。

4.5.2 培養基成分檢測與代謝控制

4.5.2.1 基質消耗的檢測

營養消耗和代謝廢物及目標產品積累的監測是檢測的主要內容。營養的消耗可以用葡萄糖的減少為指示，而產物的積累可以用乳酸和銨的增加作為指示，動態檢測這兩種物質的變化，就能反應細胞的生長和代謝過程，從而判別細胞的狀態是否正常。

在分批式培養中，葡萄糖的起始濃度一般為5～25 mM，谷氨酰氨的起始濃度為2～6 mM。在雜交瘤細胞培養的終點，乳酸的最終濃度將是葡萄糖起始濃度的1.7倍，氨離子濃度為2～4 mM。銨離子和乳酸是細胞代謝的副產物，將抑制哺乳動物細胞的生長。丙氨酸是很多的細胞的代謝副產物，但一般認為對細胞沒有毒害。銨鹽很容易積累達到1～5 mmol/L，就降低細胞生長速率。銨離子干擾了電位梯度、胞內pH改變和凋亡，銨的無效循環增加了維持細胞的能量負荷。銨還對蛋白質產物的糖基化產生嚴重的影響。乳酸的影響主要是分泌進入培養液，改變了培養的pH環境。在自動控制的生物反應器內，乳酸的濃度很少達到毒害水平（約60 mmol/L）。

對于固定化床和中空纖維反應器，不可能直接獲得細胞，因此細胞技術和生物量檢測就很困難。可以用NMR分析培養空間的成分。把細胞置于NMR中，產生特征圖譜，從而鑒定和定量代謝產物。也可分析細胞的分布，甚至是區分增殖和非增殖細胞。

4.5.2.2 代謝控制

如果存在過量的葡萄糖，細胞將消耗90％以上葡萄糖作為乳酸分泌到培養液，即使在完全有氧條件下也如此。同樣，流加過量的谷氨酰胺會導致銨離子、丙氨酸或天門冬氨酸的積累。代謝副產物乳酸和銨離子會抑制動物細胞的生長。藥物生產使用的動物細胞系一般都是連續細胞系，對細胞增殖失去了控制。與此同時，遺傳突變增加了細胞對葡萄糖和氨基酸的消耗。細胞代謝流加快才能滿足細胞的快速生長。

限制葡萄糖的流加量，將減少乳酸的總量，也減少由葡萄糖直接生成乳酸的量，增加葡萄糖的產量系數。在葡萄糖限量時，大部分葡萄糖主要用于氧化和生物合成，這與微生物的情形類似。限制谷氨酰胺的流加量，同樣可減少銨鹽和氨基酸的生成。如果進行雙控制（同時控制葡萄糖和谷氨酰胺），乳酸和銨離子將同時減少。通過葡萄糖和谷氨酰胺控制使細胞代謝變得更有效。在生產工藝中，優化二者之間的關系，使之代謝協調起來，對生產過程顯得十分重要。

在代謝控制中，有必要檢測細胞的活力、ATP、DNA和蛋白質的含量，和生物量或細胞計數、底物和產物代謝變化的相結合，評價代謝過程，建立調控模型，進行有效控制。

4.5.3 溶解氧的檢測與控制

培養基中的溶氧水平直接影響細胞的代謝。低氧水平阻礙細胞代謝，而過高氧濃度下，細胞會產生氧自由基，對細胞造成傷害。在細胞的生長過程中，要嚴格控制培養液中的溶解氧。不同動物細胞類型對溶解氧要求不同，一般而言，動物細胞對氧的消耗速率為0.006～0.3 μmol/106細胞小時或2.4mg/106細胞天或4.5～4.8×10－12g/cell.h。大部分細胞在較大的氧壓范圍（15％～90％DO）內生長良好。耗氧率受細胞類型、細胞密度、培養的增殖率、葡萄糖濃度以及谷氨酸鹽濃度的影響。耗氧速率在一定的溶氧濃度范圍內可近似為一常數，但氧分壓低于5～10mmHg時，攝氧速率會減小。一般而言，動物細胞對氧的比消耗速率為0.003～0.5 μmol/106細胞.小時,CHO的耗氧比速率為0.15，BHK-21為0.2，鼠雜交瘤為0.03～0.48。

根據生物反應器內的氧平衡原理，供氧方式必須保證氧濃度高于臨界氧濃度，提高氧傳質系數、傳質面積、傳質動力都能改善供氧。大規模生物反應器必須直接鼓泡通氣或使用膜通氣。在搖瓶或轉瓶培養時，只有保持瓶內足夠的空間，不超過三分之一體積的培養液，就能通過液面交換氣體。

在攪拌罐反應器和鼓泡反應器中，常使用剪切保護劑以保護細胞。在高鼓泡速率下，0.1％～0.2%(w/v)的非離子表面活性劑（聚丙二醇與環氧乙烷的加聚物）、F－68（BASF）對雜交瘤細胞具有很強的保護作用。為防止鼓泡生物反應器中形成泡沫，可用濃度為6—100 ppm的硅消沫劑，而且在這個濃度范圍對細胞生長幾乎沒有影響。鼓泡塔式生物反應器的通氣速率為1VVh，噴氣攪拌式生物反應器的攪拌速率為0.1-1VVh。較低通氣速率可降低消沫劑和剪切保護劑的使用量。

在大規模生產中，反應器設計都有溶氧檢測裝置，可直接讀取。根據不同細胞類型的最適溶氧水平不同，通過向培養液中加入不同比例的氧氣、空氣或氮氣或二氧化碳來控制溶氧量， 溶氧量的控制常常與pH值控制結合在一起，根據需要使用。

4.5.4 pH值檢測與控制

動物細胞培養基呈偏堿性，常給培養基中加入微量酚紅指示劑，根據指示劑顏色的變化，可以直觀顯示培養基pH變化。在開始培養時，培養液pH為7.4。在培養過程中，由于隨著細胞濃度的增加，產生了較多的CO2和乳酸，pH會下降，但必須控制不能低于pH7.0。精確控制pH非常重要，一般為6.7～7.9,其波動范圍為0.05～0.9。雖然很多雜交瘤細胞最佳pH為7.0左右，但下降在6.8時，會抑制生長。

在大規模培養中，有pH計能隨時檢測。直接加酸或堿不適合動物細胞培養。常用碳酸氫鹽緩沖劑，通入CO2來調節pH。培養基中pH值取決于CO2和碳酸氫鹽的濃度比，加入CO2可降低pH值，加入碳酸氫鹽可提高pH值。但碳酸氫鹽緩沖液的緩沖能力弱，安全的作法是通過控制溶氧量間接控制pH值，但增加溶氧量會使培養基中CO2被置換出來，導致pH值升高。因此應該合理配置，從而達到控制的目的。

4.5.5 溫度檢測與控制

動物細胞對溫度變化很敏感，對溫度控制要求十分嚴格。采用高靈敏的溫度計（靈敏度為±0.25℃）來在線檢測，將溫度控制在誤差為0.5度的范圍內。根據溫度探針，進行反饋控制，可采用預加熱培養基，或加熱周圍的水套層，使溫度恒定。

4.5.6 攪拌剪切檢測與控制

攪拌混合為生物反應器提供了均相環境，提高了氧及其他營養物質的傳遞速率。但攪拌產生剪切力會對哺乳動物細胞造成損傷。過度攪拌引起的細胞損傷可用懸浮培養中的胞外蛋白濃度來表征，它決定了細胞的裂解程度。最常用的是細胞質中的乳酸脫氫酶（LDH），在指數生長階段，細胞內LDH水平是一常數。在不同攪拌條件下，通過監測LDH的增加來評價細胞損傷程度。

攪拌速度與細胞損傷之間的關系是與反應器的結構有關，不同生物反應器產生不同的細胞應力。細胞承受的機械應力取決于攪拌槳設計及其直徑和轉速、罐體設計及其直徑以及液相的比例。

4.5.7 目標產物的檢測與控制

生產過程中也要對細胞分泌的目標產物進行跟蹤檢測，這可根據目標產物的性質，采取各種免疫方法進行測定，判斷細胞是否在有效地合成并積累目標蛋白質。

動物細胞培養的產物并非100％具有生物活性，它取決于糖基化完整性和蛋白酶的降解程度。細胞生長的環境對它影響很大，包括培養方式、生長時期、葡萄糖和氨離子濃度及其它培養液的成分和pH、氧濃度等。選擇適宜的生理狀態對獲得糖基化正確的蛋白質產物非常重要。

很多因素影響蛋白質產物的產量，可用比生產速率表征，提高生長速率對增加產量有積極作用。動物細胞的產物濃度通常用占總蛋白的百分數或用一定細胞數目的產物量表示。非培養液成分能增加比生產速率，有報導滲透壓從正常的330升到400，提高了比生長速率。另外，添加丁酸也能提高比生長速率，可能是丁酸使細胞滯留在G1期。骨髓瘤細胞系生產重組抗體，生長速率從0.016增加到0.042，生產速率從18％提高到29％。

4.6 重組人紅細胞生成素生產工藝

4.6.1 紅細胞生成素概述

4.6.1.1 紅細胞生成素的種類

紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）對紅細胞生成的特異性刺激作用的細胞因子。紅細胞生成素是一種糖蛋白，在胎兒體內由腎臟及肝臟產生，而在成人體內主要由腎臟產生。腎功能受到損害，如慢性腎衰竭的病人，紅細胞生成素的產生受阻，可導致貧血。正常人體內血液中紅細胞生成素的含量為10～18 mU/ml。當體內缺氧時，紅細胞生成素的含量可提高到1000倍以上。紅細胞生成素與靶細胞如骨髓細胞、脾細胞、胎兒肝細胞的特定位點結合，從而促進紅細胞前體細胞的增殖、分化并成熟為紅細胞，增加骨髓向循環血中釋放紅細胞。

天然紅細胞生成素是以人或動物的尿、血等為原料，經生物化學方法純化得到。根據種屬不同可分為人紅細胞生成素、小鼠紅細胞生成素、猴紅細胞生成素等。目前已知人紅細胞生成素有兩種存在形式，即人EPO-α及人EPO-β，二者氨基酸組成及順序相同，都含有165個氨基酸殘基。分子量、等電點及生物活性也都類似，差別在于二者的糖型組成不同，EPO-α含有較多的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神經氨酸，總的含糖量也較EPO-β高。

　 重組人紅細胞生成素，是以重組DNA技術生產的紅細胞生成素，將紅細胞生成素的基因連接到表達載體上，轉化CHO細胞，從細胞培養上清液中純化得到紅細胞生成素。重組人紅細胞生成素與天然人紅細胞生成素具有相同的體內、體外活性，比活基本相當。同天然人紅細胞生成素一樣，基因工程人紅細胞生成素依據糖基結構的差異也可分為α、β兩種，即rhEPO-α和 rhEPO-β。

4.6.1.2 紅細胞生成素的臨床應用

紅細胞生成素的促進紅細胞生成作用已得到大量動物實驗和臨床實驗的證實，主要作用于紅系集落生成單元（CFU-E），通過與CFU-E中的紅細胞生成素受體結合而加速CFU-E的分化和增殖，促進其產生紅細胞，維持外周血的正常紅細胞水平。

已獲批準的適應癥主要有腎性貧血、艾滋病患者貧血、癌癥相關貧血等。除以上已獲批準的適應癥外，紅細胞生成素尚有潛力用于自體供血、術后貧血、早產兒貧血、骨髓移植、再生障礙性貧血、類風濕關節炎患者貧血、骨髓增生異常綜合癥患者貧血、鐮刀形紅細胞性貧血、地中海貧血等。

自從1989年FDA批準紅細胞生成素[Amgen公司Epogen、Ortho Biotech公司Procrit] 用于臨床連續治療需要透析的慢性腎衰病人以來，很多國家也已經批準紅細胞生成素上市和生產。

重組紅細胞生成素(EPO)是目前臨床上治療慢性腎衰性貧血療效最顯著的生物技術藥物。銷售額一直排在生物醫藥類產品的前三名，每年的增長率在10％以上，2000年，紅細胞生成素的全球銷售額達到了42億美元。

4.6.1.3 紅細胞生成素的物理化學性質

成熟的紅細胞生成素是由165個氨基酸殘基組成的糖蛋白，糖基化位點為Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2對半胱氨酸組成的二硫鍵(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量為34～36 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超濾)或60 ku（凝膠電泳）。紅細胞生成素前體帶有27個氨基酸的信號肽。紅細胞生成素基因存在于7q11-q22區的一個5.4 kb HindⅢ-BamHⅠ性內切酶切片段中。

用沉淀平衡法測定紅細胞生成素分子量為34 kD，其中肽鍵部分從其氨基酸組成序列推算為18398D，據此推測其糖鏈占分子量的39%。圓二色譜表明人紅細胞生成素的肽鏈骨架50％為α-螺旋，其余為無規則卷曲結構，其中兩個反平行的α-螺旋組成類似于生長激素的結構。紅細胞生成素分子中糖鍵結構也已明確。126位O糖鏈的主要組成為N-NeuNAC α-2→3Gal β1→3 (NeuNAC α-6) Gal NAcOH－絲氨酸。各種N連接寡糖鏈結構占總含糖量的百分率分別為：雙末梢糖鏈1.4%，三末梢糖鏈10%，帶有一個N-乙酰氨基半乳糖重復單位的三末梢糖鏈3．5%，四末梢糖鏈31.8%，帶有一個、兩個和三個N-乙酰氫基半乳糖重復單位的四末梢糖鏈分別為32.1%，16.5%和4.7%。所有這些寡糖鏈都被以α2→3連接方式唾液酸化了,其中四末梢糖鍵被2個或3個唾液酸殘基唾液酸化。另外還發現天然和重組人紅細胞生成素僅唾液酸含量有微小差異，其它糖鍵結構并無不同。未經O糖基化的重組人紅細胞生成素的體內外活性及體內清除速率與完全糖基化的紅細胞生成素無差別，N糖基化不完全的重組人紅細胞生成素體外活性正常，而體內活性則降低到體外活性的1/500，其體內被清除的速率也明顯加快。糖基化紅細胞生成素對熱和pH變化穩定，等電點為4.2～4.6，未經糖基化肽鏈等電點pH為9.2。

4.6.1.4 紅細胞生成素的表達研究

早期，人源的紅細胞生成素由再生障礙性貧血患者的尿液中純化而得，但這種方式獲得的紅細胞生成素產量極其有限，無法滿足臨床及科研的需求。重組DNA技術的發展，為大量生產人紅細胞生成素提供了一條新的途徑。

Jacob等從基因文庫中克隆并測序了編碼紅細胞生成素的DNA片段，同時，以核酸探針從λ噬菌體cDNA文庫中篩選得到了編碼紅細胞生成素的cDNA片段，以此構建了SV40病毒啟動子驅動表達的載體，在猴腎纖維母細胞COS-1中進行瞬時表達，測得了紅細胞生成素的生物活性。Lin等(1985)由人基因組中獲得編碼紅細胞生成素的基因，將其轉入中國倉鼠卵巢細胞系（CHO）中，獲得穩定的表達。

Quelle等利用昆蟲SF9細胞中的桿狀病毒系統表達rhEPO。雖然經轉化的SF9細胞生產的rhEPO的產率有所改善，但是目標產物rhEPO的糖基化程度較天然紅細胞生成素為小，因而其分子量亦較小。Mori等人構建了一個含有干擾素-α基因啟動子的rhEPO表達載體，并利用該rhEPO表達載體轉化B細胞白血病BALL-1細胞。經以仙臺病毒轉染后，轉化的B細胞白血病BALL-1細胞比現有技術所得的轉化株能產生較高量的rhEPO。

重組紅細胞生成素在大腸桿菌中也得到表達，但所得rhEPO僅具有體外抗原結合活性。至于家蠶體內的表達系統，也存在糖基化簡單，藥物在體內穩定性較低、活性較差等問題。在哺乳動物細胞CHO、BHK細胞系統中表達，獲得的重組紅細胞生成素與天然紅細胞生成素相似。故現在工業生產中多采用動物細胞培養表達紅細胞生成素進行大規模生產。

4.6.2 表達紅細胞生成素的細胞系

基因工程人紅細胞生成素的基因克隆及其在哺乳動物細胞中的表達主要過程如下。

4.6.2.1 構建紅細胞生成素表達載體

有兩種方式獲得編碼人紅細胞生成素基因。一種是提取胎肝染色體DNA，然后以特異性寡核苷酸為引物，經聚合酶鏈式反應擴增出人紅細胞生成素的基因片段，然后與克隆載體連接，克隆基因。另一種是提取人胎肝mRNA，逆轉錄合成cDNA文庫，進行文庫篩選，得到人紅細胞生成素基因。

將人紅細胞生成素基因與表達質粒重組，導入哺乳動物細胞，經篩選得到表達人紅細胞生成素的細胞株。常用的表達載體有這兩種質粒帶有二氫葉酸還原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表達載體。常用的宿主細胞為CHO細胞。

構建載體經過篩選后，必須通過測序，確證紅細胞生成素的DNA序列及其推導的氨基酸序列是正確的。

4.6.2.2 構建表達紅細胞生成素的細胞株

以二氫葉酸還原酶缺陷型的中國倉鼠卵巢細胞系（CHO dhfr-）為宿主細胞。將此細胞培養于100 mm培養皿中，待細胞長滿至50%～60%時，用無血清細胞培養基淋洗細胞，加入由無血清培養基、表達載體和共轉化載體，以及lipofectin組成的共轉染混合液，37℃培養4小時。吸出培養基，加入含10%胎牛血清的F12培養基，37℃培養過夜。隨后在含青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的DEME中培養，獲得抗性克隆。逐步提高MTX終濃度，篩選抗性克隆。利用酶聯免疫分析法確認所得到的細胞表達人紅細胞生成素。

4.6.3 CHO細胞培養工藝過程

在獲得了能夠高效表達目的蛋白的重組細胞株以后，需要解決的問題就是通過培養而大量生產出目的蛋白。常規動物細胞培養的方法是將細胞放在不同的容器中進行培養。如利用轉瓶大量培養貼壁細胞或用生物反應器培養貼壁或懸浮細胞。

轉瓶培養細胞工藝簡單，規模易于擴大，污染易于控制，一直用于疫苗工業的生產，是傳統的細胞培養生產工藝。美國Amgen公司是世界上最早獲得人紅細胞生成素生產和上市的企業，采用的生產工藝即是轉瓶培養生產工藝。以下介紹生物反應器培養工藝。

4.6.3.1 種子細胞制備

（1）凍存的細胞株37℃水浴復蘇，無菌離心，棄去凍存液。

（2）加入適量DMEM培養基（含10%小牛血清）。

（3）37℃二氧化碳培養箱培養，連續傳三代。

（4）細胞消化后接種，接種的細胞濃度約為2.5×106個/ml。

6.4.3.2 反應器連續培養

（1）加入纖維素載體片及pH7.0的PBS緩沖液，5L細胞反應器高壓滅菌1.5小時。

（2）將反應器接入主機，連接氣體，校正電極，排出PBS緩沖液。加含有小牛血清的DMEM培養基，接種。控制條件pH7.0，攪拌轉速<50 r/min，37℃，DO 50%～80%，進行貼壁培養。

（3）轉速提高到80~100 r/min，繼續擴增培養10天。

（4）更換為無血清合成培養基，由軟件控制溫度、溶氧、pH值等培養條件，進行連續灌流培養。

（5）收獲培養物，4℃~8℃保存。

4.6.3.3 培養工藝控制

生物反應器由于各種輔助配件比較完善、因此具有許多優點，如無菌操作安全可靠、保溫和氣體交換可靠，能保持pH值穩定，監視控制自動化，產物的收集和新液的補充持續進行以及載體有足夠的表面積等，非常適于基因工程細胞的高密度、高表達連續培養。但不同的細胞，其最適生長和表達條件不完全相同，必須摸索出最適培養條件。

在剛接種后細胞稀少時，攪拌速度緩慢，使細胞牢固地貼附于載體上，隨著細胞數量的增加逐漸提高攪拌速度，以便使細胞周圍的微環境中代謝產物和營養物質都在較短的時間內達到平衡。

動物細胞培養對溫度波動的敏感性很大。因此，對溫度的控制應較為嚴格。恒定的溫度(37℃)及pH值(7.2)也是較為理想的條件。

pH值也是細胞培養的關鍵性參數，它能影響細胞的存活力、生長及代謝。細胞生長的最適pH值因細胞類型不同而異，應先通過實驗尋找出最適pH值，再通過輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定。細胞生長與表達的pH值為7.0~7.2。

氧是細胞代謝中最重要的養分之一。它可以直接和間接地影響細胞的生長與代謝。溶解氧應在10％~100％的范圍內。可根據需要向培養液內加入氧氣、空氣或氮氣按比例的混合氣體以控制溶氧。

葡萄糖是細胞生長與表達過程中必不可少的碳源之一，其消耗程度直接反映出細胞代謝旺盛程度，細胞生長、表達旺盛時，需大量消耗，而缺乏時細胞生長速度與產物表達量均降低，故應及時充分地予以補充。此外還應監測氨、乳酸鹽類等代謝廢物在培養基中的含量，維持在較低的濃度，減少對細胞損害。

雖然采用有血清培養基有效刺激細胞的分化和增殖，但無血清的合成培養基用于生產，可降低純化過程中雜蛋白質的含量，減少純化的負載，并延長層析色譜柱使用壽命，有效提高產品的純度。

4.6.4 紅細胞生成素的分離純化工藝過程

4.6.4.1 紅細胞生成素的初級分離

①CM－Sephrose親和層析柱預先用Na-HAc-異丙醇活化，并用20 mmol/L TrisHCl平衡緩沖液平衡。

②收獲培養基濾膜過濾后上CM親和層析柱，平衡緩沖液平衡。

③0～2 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris洗脫液梯度洗脫。

④收集活性洗脫峰10 mmol/L Tris透析液透析過夜。

4.6.4.2 紅細胞生成素的精制

①透析后的活性組分上預先平衡的DEAE離子交換柱。

②0～1 mol/L NaCl- Tris洗脫液梯度洗脫，收集活性洗脫峰。

③上10%乙腈平衡的RP-HPLC柱（C4填料），10%～70%的乙腈溶液梯度洗脫，收集活性洗脫峰。

④上凝膠柱（預先用20 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液平衡），20 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液平衡并洗脫，收集活性洗脫峰（紅細胞生成素）。

在透析過程中，透析液的體積為蛋白液的15倍體積，過夜，并分四次換液。在上離子交換柱前用0.22 μm濾膜過濾。在上RP-HPLC柱前樣品蛋白含量為0.37 mg/ml，經無菌過濾后制成粗品再進一步純化。在上凝膠柱前蛋白含量約為1.0 mg/ml，最后得到產品蛋白含量為1.2 mg/ml，其比活>1.2×105 IU/mg。

4.6.5 紅細胞生成素的質量控制

4.6.5.1 紅細胞生成素的活性檢測

得到紅細胞生成素純品后，測定純度、蛋白含量、分子量等物理化學性質和體內生物學活性。

紅細胞生成素的體外活性即免疫學活性，用酶聯免疫分析試劑盒檢測。試劑盒內含有標準重組人紅細胞生成素。將待測品稀釋后，進行酶聯免疫分析，依照其OD值，以內標法計算樣品相對于標準品的活性。

紅細胞生成素的體內生物活性測定：采用網織紅細胞計數法。選用6－8周齡的同性別 BALB/c小鼠分為三個計量組，每組兩只。分別于腹部皮下注射紅細胞生成素標準品和稀釋樣品以2IU/只，4IU/只,8IU/只劑量注射；連續注射三天后，眼眶取血，染色，涂片計數1000個紅細胞中的網織紅細胞數，同時也計算原血中的紅細胞數，兩值相乘為原血中網織紅細胞絕對數。以注射劑量為橫坐標，網織紅細胞絕對值為縱坐標，求得待測樣品的體內生物學活性，并計算樣品稀釋前的濃度。

4.7 單克隆抗體生產工藝

4.7.1 概述

4.7.1.1 抗體

抗體是能與相應抗原特異性結合的具有特定功能免疫的球蛋白，它與免疫球蛋白的區別在于，抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗體活性功能。所以抗體是一個生物學和功能性概念，而免疫球蛋白是一個結構性概念。除抗體之外，還包括正常天然存在的免疫球蛋白和病理條件下的免疫球蛋白及其亞單位。

19世紀末是通過免疫動物從血清中獲得抗體，20世紀70年代建立了B細胞雜交瘤生產單克隆抗體技術即細胞工程抗體，80年代中期開始了基因工程人源化抗體的研究，90年代開始用抗體庫技術篩選小分子抗體，并用原核細胞表達抗體，即基因工程抗體。抗體工程技術使抗體的應用超出了原有范疇，在疾病的診斷、檢測和治療中越來越顯示出巨大的前景。

4.7.1.2 抗體的結構

Ig分子的特點使功能和結構的雙重性：為了識別不同抗原，需要數量巨大的結構多樣性；但在發揮體內效應時，需要結構的穩定性。雖然Ig分子是體內最復雜的分子，但具有相似的基本結構，其單體由2條相同的重鏈（heavy chain, H鏈）和2條相同的輕鏈（light chain，L鏈）組成的四聚體。

每條鏈分為兩個區，可變區（Variabl region, V區）和恒定區（constant region，C區）。V區從多肽的N端起，包括輕鏈的1/2和重鏈的1/4，其氨基酸的序列變化較大，隨抗體的特異性不同而不同。其中高可變區（Hypervariable region, HV區）或互補決定區（Complementary determining region, CDR）是抗原特異結合部位。C區從多肽的C端起，包括輕鏈的1/2和重鏈的3/4，同類抗體這部分氨基酸序列變化不大。重鏈約由450個氨基酸殘基（IgG、IgA、IgD）或570個氨基酸殘基（IgM、IgE）組成，分子量50～75 ku，重鏈糖基化。輕鏈由214個氨基酸殘基組成，分子量25 ku，輕鏈無糖基化。Ig對稱結構，輕重鏈之間和重鏈之間以二硫鍵連接，形成一“Y”字型結構。

根據V區抗原性的不同，對應的抗體是IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，它們的理化和免疫特性互不相同。輕鏈有兩類κ和λ，分子量相同23000，由214個氨基酸組成。

4.7.1.3 抗體的分類

根據抗體的生產技術和發展，可把抗體分為以下三代。

第一代抗體為多克隆抗體（polyclonal antibody,），由早期傳統的方法制備的抗體，把天然抗原經各種途徑免疫動物，分離提取的免疫血清。由于抗原物質具有多種抗原決定簇，所產生的抗體是多種抗體的混合物。由于抗體不均一，臨床應用受到限制。

第二代抗體為單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)是由識別一種抗體決定簇的細胞克隆所產生的均一抗體。具有特異性高、親和力強、效價高、血清交叉反應少的優點，應用于臨床的抗腫瘤、抗感染、解毒、抗器官移植排斥反應等。第二代抗體主要形式有二種，全抗體和酶解片段抗體。如木瓜蛋白酶水解片段、胃蛋白酶水解片段等。一般用雜交瘤（hybridoma）的鼠生產，所以稱為鼠源單克隆抗體。其缺點是有鼠源性，對人體有較強的免疫原性（immunogenicity）；半衰期短，靶向吸收差，全抗體分子量大，很難通過血管進入細胞，特別是腫瘤等部位含量低，降到了療效。生產復雜，價格高貴。

第三代抗體是指用基因工程方法，對抗體的基因進行重組、缺失、修飾改型等，構建載體，在受體細胞中表達，獲得的抗體。包括鼠源抗體的人源化，人鼠嵌合抗體，改型抗體，小分子抗體。

小分子抗體是分子量較小的具有抗原結合功能的抗體分子片段，是近幾年的研究熱點。根據抗體的各個結構域功能進行構建，可分為Fab抗體，單鏈抗體、單域抗體和超變區抗體。具有以下優點：可以在大腸桿菌等細胞中原核表達，生產成本低；容易穿透血管壁或組織屏障，進入病灶部位，有利于治療腫瘤等；不含有Fc片段，不與Fc受體結合；有利于進一步進行基因工程改造。

4.7.2 鼠源單克隆抗體制備

鼠源單克隆抗體是用動物鼠來生產的，先制備鼠雜交瘤細胞系，然后在體內或體外生產抗體。雜交瘤雜交瘤細胞系的制備工藝包括免疫動物、親本細胞的制備、細胞融合、培養篩選與鑒定、克隆化等過程。

免疫的B淋巴細胞分化為漿細胞，是產生特異性抗體的細胞，但漿細胞還不能在體外培養基中成功生長，因而不能成為體外生產抗體的來源。骨髓瘤細胞（myeloma cell）雖然能在培養基中生長且比正常細胞生長繁殖速度快，但不能產生抗體。將這二種功能細胞進行融合，就可把免疫淋巴細胞具有特定抗體基因的染色體引進至一種長期生長的骨髓瘤細胞，這樣所得到的雜交瘤細胞，既具有體外長期迅速增長的能力，又能持續產生和分泌特定單一成分的特異性抗體。

4.7.2.1 雜交瘤細胞系的制備

（1） 制備B淋巴細胞

用目的抗原，按照免疫程序，對純系健康8周齡的BALB/c小白鼠進行免疫，分離B淋巴細胞。

（2）原生質體融合

用1000~4000的聚乙二醇（polyelhylene glycol, PEG）為細胞融合誘導劑。取生長旺盛、形態良好、處于對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞懸液與新鮮制備的BALB/c淋巴細胞懸液，置于37℃水浴中，加入PEG4000（pH7.2～7.4），進行細胞融合。沿管壁加入DMEM或RPMI-1640培養液，終止其誘導作用。

（3）雜交瘤篩選與克隆化

在兩類細胞的融合混合物中存在五種細胞，未融合的單核親本細胞、同型融合多核細胞、異型融合的雙核和多核雜交瘤細胞。從中篩選純化出異型融合的雙核雜交瘤細胞是目的。未融合的淋巴細胞在培養過程6～10天會自行死亡，異型融合的多核細胞由于其核分裂不正常，在培養過程中也會死亡，對雜交瘤細胞影響不大。但未融合的骨髓瘤細胞因其生長快而不利于雜交瘤細胞生長和分離。

經反復克隆化培養獲得抗體陽性雜交瘤細胞株后，應立即擴大培養。凍保存液為含10％二甲亞砜的胎牛血清，雜交瘤細胞懸浮于胎牛血清中，濃度為5×106/ml，雜交瘤細胞懸浮液與凍保存液等體積混合，每安瓿瓶分裝1 ml，在液氮中長期保存。

4.7.3 雜交瘤細胞的培養

目前單克隆抗體的生產包括體內培養和體外培養兩種，體內培養是利用生物體作為反應器，主要是在小鼠或大鼠的腹腔內，雜交瘤細胞生長并分泌單克隆抗體，是目前商業用單克隆生產的主要方法。

先給BALB/c小鼠或與 BALB/c小鼠雜交的F1小鼠注射0.5ml異十八烷或液體石蠟使之致敏，8～10天后，向腹腔接種106～107雜交瘤細胞。2～4天后腹部漲大。1～2周時開始抽取腹水，隔日采集3～5 ml抽取腹水，直至動物死亡。也可在最大腹水時處死動物，一次性抽取腹水。另外還可用血清來生產單克隆抗體，將雜交瘤細胞皮下植入動物體內，一段時間后，出現腫瘤，采集血清制備單克隆抗體，一般血清中抗體的含量為1～10 mg/ml，但血清非常有限。體內法所產生的抗體滴度比體外懸浮法高1000倍，每ml腹水含單克隆抗體1～26 mg，一只小鼠可得10ml腹水，而大鼠可得50ml腹水。

體外培養法有懸浮培養、包埋培養和微囊化培養幾種。小規模生產采用滾瓶或轉瓶，大規模采用反應器罐。滾瓶培養先進行種子培養，逐級放大，但抗體濃度低，5～10μg/ml。發酵罐培養時，細胞密度增加，抗體含量為10～100 μg/ml。雜交瘤細胞的懸浮培養產生的抗體滴度較低，一般為5～100 μg/ml，細胞密度不高。培養基多用無血清，離心除去細胞，上清經超濾，鹽析可得粗制品。包埋培養和微囊化是抗體生產的好方法。抗體被截留在微囊內，有利于分離純化。細胞經過增長期生長之后進入穩定期，細胞密度為6×107/ml，抗體的處理和純度隨時間延長而增加，可生產抗體0.5～1 g/L，微囊內抗體純度約50％，離子交換層析后可達99％。

4.7.4 單克隆抗體的分離純化

收集到腹水或培養液上清，離心去除細胞等雜質，對上清進一步分離和純化。通過離子交換、凝膠過濾、親和層析等方法獲得純化的單克隆抗體。

（1）離心

將紅細胞、細胞碎片及其它粒子如脂類、內毒素、核酸、等分離除去，澄清溶液。2000 g離心30分鐘。加入硅膠及其他吸附劑，有利于分離。還可加入助濾劑，或切向流過濾。

（2）沉淀

收集細胞培養液，用硫酸銨沉淀，獲得粗品。當硫酸銨的終濃度為飽和濃度的50％時，90％的單克隆抗體沉淀出來。對單克隆抗體濃縮和分離非常有效。通常采用辛酸—硫酸銨沉淀，親和層析或硫酸銨-二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）離子交換層析獲得單克隆抗體。

（3）純化

根據抗體的亞型選用離子交換、Protein A-sephrose 4B 和Protein G-sephrose 4B親和層析，羥基磷灰石分離、疏水層析。凝膠過濾等進一步純化。

8.1 工藝設計圖

工藝設計圖是生產工藝設計的主要圖紙，通常包括工藝流程圖、設備布置圖和管道布置圖，一般應按不同設計階段的要求和規定進行繪制。圖樣的種類及其主要表達內容可參考表8-1。其中設備圖由設備專業人員設計繪制，工藝設計圖則由工藝專業人員設計繪制。

表8-1 工藝設計圖樣及其內容

初步設計 施工設計 內容

工藝設計圖

全廠總工藝流程圖，物料平衡圖 全廠總工藝流程，物料衡算結果

物料流程圖 車間（裝置）的物料流程，物料平衡，設備特征，換熱器的熱量平衡等

帶控制點工藝流程圖 帶控制點工藝流程圖，輔助管道系統圖，蒸汽管系統圖 車間（裝置）或工段中的主輔管道、生產設備、儀表、管件、閥門的配制

設備布置圖 首頁圖，設備布置圖，設備支架圖，管口方位圖 車間（裝置）、工段中生產設備、操作平臺等的具體位置和安裝情況，支架、平臺的詳細結構

管道布置圖 管道布置圖，蒸汽管布置圖，管段圖，管架圖，管件圖 車間（裝置）、工段的管道、管件、閥門、管架及儀表檢測點的位置，安裝情況，管段、管件的詳細結構

設備圖

非定型關鍵總設備圖 非定型總設備圖及零部件圖，設備總圖，部件，零件的結構形式、尺寸、材質、數量、技術要求等

定型設備總圖及零部件圖 設備的主要結構形式、尺寸、技術特征

8.1.1 工藝流程圖

工藝流程圖是用來表達工藝生產流程的圖樣。一般有如下幾種：

8.1.1.1 工藝流程示意圖

工藝流程示意圖是在生產路線確定后，物料衡算設計開始前表示生產工藝過程的一種定性圖紙，有框圖和流程簡圖兩種表示方法，如圖8-1所示的阿司匹林工藝流程方框圖和圖8-2所示的工藝流程簡圖。

8.1.1.2 全廠總工藝流程圖或物料平衡圖

總工藝流程圖是為總說明部分提供的全廠總流程圖樣，有的工廠則改稱為全廠物料平衡圖。

8.1.1.3 物料流程圖

工藝流程示意圖完成后，開始進行物料衡算，再將物料衡算結果注釋在流程中，即成為物料流程圖。它說明車間內物料組成和物料量的變化，單位以批(日)計(對間歇式操作)或以小時計(對連續式)。從工藝流程示意圖到物料流程圖，工藝流程就由定性轉為定量。

對應于工藝流程示意圖，物料流程圖也有兩種表示方法:

① 以方框流程表示單元操作及物料成分和數量，如圖8-3和8－4所示。

② 將物料衡算和能量衡算結果直接加進工藝流程示意圖中，得到物料流程圖，

8.1.1.4 帶控制點工藝流程圖

帶控制點工藝流程圖是表示全部工藝設備、物料管道、閥門、設備附件以及工藝和自控儀表的圖例、符號等的一種內容較為詳細的工藝流程圖，也稱生產控制流程圖或工藝控制流程圖。

8.1.2 設備布置設計

設備布置設計的最終成果是設備布置圖等一系列圖樣，它包括：

(1)設備布置圖 表示一個車間或一個工段的生產和輔助設備在廠房建筑內外安裝布置

的圖樣。

(2)首頁圖 車間內設備布置圖需分區繪制時，提供分區概況的圖樣。

(3)設備安裝詳圖 表示用以固定設備的支架、吊架、掛架及設備的操作平臺、附屬的棧橋、鋼梯等結構的圖樣(施工圖設計內容之一)。

(4)管口方位圖 表示設備上各管口以及支座、地腳螺栓等周向安裝方位的圖樣(施工圖設計內容之一)

8.1.3 管道布置圖

管路的布置設計首先應保證安全、正常生產和便于操作、檢修，其次應盡量節約材料及投資，并盡可能做到整齊和美觀以創造美好的生產環境。

8.2 物料衡算

根據質量守恒定律，以生產過程或生產單元設備為研究對象，對其進出口處進行定量計算，稱為物料衡算。

8.2.1 物料衡算的理論基礎

物料衡算有兩種情況：

① 針對已有的生產設備和裝置，利用實際測定的數據，計算出一些不能直接測定的物料量。利用計算結果，對生產情況進行分析和判斷，提出改進措施；也可用于檢查原料利用率和“三廢”處理情況。

② 為了設計一種新的設備或裝置，根據設計任務，先作物料衡算，再經能量平衡求出設備或過程的熱負荷，從而確定設備尺寸及整個設備流程。

物料衡算的基礎是物質的質量守恒定律，即進入一個系統的全部物料量必等于離開系統的全部物料量，再加上過程中的損失量和在系統中的積累量。

式中 ΣG1──輸入物料量總和；

ΣG2──輸出物料量總和；

ΣG3──物料損失量總和；

ΣG4──物料積累量總和。

當系統內物料積累量為零時，上式可以寫成：

根據上述定義可得到化學過程的物料衡算的基本關系式為：

進入反應器的物料量—流出反應器的物料量—反應器中的轉化量＝反應器中的積累量

在化學反應系統中，物質的轉化服從化學反應規律，可以根據化學反應方程式求出物質轉化的定量關系。

8.2.2 確定物料衡算的計算基準及每年設備操作時間

8.2.2.1 物料衡算的基準

物料衡算的基準是：

(1)以每批操作為基準，適用于間歇操作設備、標準或定型設備的物料平衡，合成藥物的生產以間歇操作居多。

(2)以單位時間為基準，適用于連續操作設備的物料衡算。

(3)以每公斤產品為基準，以確定原材料的消耗定額。

連續生產的原料藥，在一定時間間隔內生產的在規定限度內的均質產品為一批；間歇生產的原料藥，可由一定數量的產品經最后混合所得的在規定時間內均質產品為一批。

8.2.2.2 每年設備操作時間

車間設備每年正常開工生產的天數，一般以330天計算，余下的36天作為車間檢修時間。對于工藝技術尚未成熟或腐蝕性大的車間一般以300天或更少一些時間計算。

8.2.3 收集有關計算數據

8.2.3.1 相關計算數據

為了進行物料衡算，應根據中試放大數據或生產操作記錄，收集下列各項數據：反應物的配料比，原輔材料、半成品、成品及副產品等的名稱、濃度、純度或組成，轉化率，階段產率，車間總產率等。

8.2.3.2 轉化率

對某一組分A來說，生成產物所消耗掉的物料量與投入反應物料量之比簡稱該組分的轉化率，一般以百分率表示。若用符號JA表示組分的轉化率，則得：

8.2.3.3 收率(產率)

某主要產物實際產量與投入原料計算的理論產量之比值，也以百分率表示。用符號Y表示，則得：

收率一般要說明是按哪一種主要原料計算得到的。

8.2.3.4 選擇性

各種主、副產物中，主產物所占比率或百分率可用符號φ表示，則得：

實際測得的轉化率、收率和選擇性等數據將作為設計工業反應器的依據，同時這些數據是評價這套生產裝置效果優劣的重要指標。

8.2.3.5 車間總收率

一個化學合成藥物的生產過程由若于物理及化學反應工序組成，車間總收率與各工序收率的關系為：

在計算收率時，必須注意質量監控，即對各工序中間體和藥品純度要有質量分析數據。

8.2.4 物料衡算的計算步驟

(1)收集和計算所必需的基本數據；

(2)列出化學反應方程式，包括主反應和副反應；根據給定條件畫出工藝流程簡圖；

(3)選擇物料衡算計算的基難；

(4)進行物料衡算；

(5)列出物料衡算表：①輸入與輸出的物料衡算表；②“三廢”排放量表；③計算原輔材料消耗定額，通常按生產1kg產品計算。

在化學合成藥物的工藝研究中，特別要注意成品的質量標準、原輔材料的質量和規格，各工序中間體的質量監控方法以及回收品的處理等，這些都是影響物料衡算的因素。表8－2為一中藥廠某車間主要物料衡算表。

表8－2 某中藥生產車間主要物料衡算表

8.3 能量衡算

8.3.1 能量衡算的理論基礎

制藥生產過程中包含有化學過程和物理過程，往往伴隨著能量變化，因此必須進行能量衡算。又因生產中一般無軸功存在或軸功相對來講影響較小，因此能量衡算實質上是熱量衡算。

熱量衡算的主要依據是能量守恒定律。在無軸功的條件下，進入系統的熱量與離開系統的熱量相互平衡。

其熱量衡算表達式為：

式中 Q1──物料進入設備帶到設備中的熱量；

Q2──由加熱劑 (冷卻劑)傳給設備和物料的熱量(加熱時取正值，冷卻時取負值)；

Q3──過程的熱效應，它分為兩類，即化學反應熱效應和狀態變化熱效應；

Q4──物料從設備離開所帶走的熱量；

Q5──消耗于加熱 (冷卻)設備和各個部件上的熱量；

Q6──設備向四周散失的熱量。

通過上式可以計算出Q2，由Q2進而可計算加熱劑或冷卻劑的消耗量。

8.3.2 計算過程

(1)所處理的物料帶到設備中去的熱量Q1，可用下式計算：

式中 G——物料的重量(kg)；

c——物料的比熱容(kJ／kg?℃)；

t——物料的溫度(℃)。

G 的數值根據物料衡算的結果而定。t的數值由生產工藝操作規程或中間試驗數據或由其他搜集得來的資料而定。至于物料的比熱容可從各種手冊中找到，在缺乏數據的情況下可根據經驗式或做實驗求取。

(2)由加熱劑(或冷卻劑)傳給設備和所處理的物料之熱量Q2，在大多數情況下為未知

數，需利用熱量衡算來求出。據此用以確定傳熱面積的大小，以及加熱劑(或冷卻劑)的用量。

(3)過程的熱效應Q3，可以分成兩類，一類是由于發生化學反應的結果，放出或吸入的熱量，一般稱為化學反應熱。另一類是由于物理——化學過程所引起的結果。此種熱量一般稱為狀態熱。

在某一過程中，有時只有化學反應熱，有時只有狀態熱，有時兩者兼有。

屬化學反應熱的有聚合熱、硝化熱、磺化熱、氯化熱、氧化熱、氫化熱、中和熱等等。這些化學反應熱的數據可以從手冊、工藝學書籍、工廠實際生產數據、中間試驗數據，以及科學研究中獲得。如果缺乏數據，可根據元素的生成熱和化合物的燃燒熱求以出。

屬狀態熱的有汽化熱、熔融熱、溶解熱、升華熱、結晶熱等等。這些數據同樣也可從手冊、化工過程及化工計算書籍等資料來源中找到。

(4)反應產物由設備中帶出的熱量Q4，計算方法同所處理的物料帶到設備中去的熱量Q1。

(5)消耗在加熱設備各個部件上的熱量Q5。

應該指出，對于連續操作的設備只需建立物料平衡和熱量平衡，不需要建立時間平衡。但對于間歇操作的設備，還需建立時間平衡。這是因為在間歇操作中，條件隨時間而改變。

設計工作中技術經濟分析的任務是對整個工廠基建投資的經濟效果、綜合性技術經濟指標，進行分析和論證，作出評價的結論。并把各項技術經濟指標和結論與國內外現有同類型的先進指標進行對比，以此說明本設計的先進性和不足，求得基建投資費最有效的利用。

8.4 工藝經濟性評價

設計工作的技術經濟分析的主要內容有以下幾項：

(1)基建投資的經濟分析；

(2)產品設計成本(或經營費用)的經濟分析；

(3)勞動生產率的分析；

(4)投產府財務效益分析等等。

技術經濟分析—般采用對比分折法對設計方案的經濟效果進行分析和論證，從中優選設計方案。其程序如下：

(1)依據設計任務書的要求，深入調查研究，掌握資料數據，提出幾種可能對比的設計方案。

(2)全面論述每一可能方案的優缺點，初步確定兩個擬比的較好的方案。

(3)計算兩個較好方案的技術經濟指標，對比分析其綜合經濟效果，最后選定最優方案。

8.4.1 產品成本的經濟分析

產品成本是由可變的費用與不變的費用來構成的。前者通稱為變動成本，后者通稱為固定成本。其表達式為：

產品成本＝變動成本十固定成本

其中，變動成本指項目費用因素中的原料、輔料、燃料及動力(水、電、汽等)消耗等，隨企業年產量(t／a)增加或降低而有增減變化；而固定成本為工人工資及附加費、車間經費、企業管理費等項。

8.4.2 基建投資費用的經濟分析

基建投資費用有投資總額，也有投資單位費用。后者是投資總額分攤到單位產品(或單位生產能力)的投資費用。

一般情況下，投資總額較大而生產效率較高的方案，有可能是經濟合理的方案。在分析基建投資時，除對方案本身的投資數量進行分析，尚需對投資費用的構成項目，如廠房建筑費、設備購置費、設備安裝工程費以及其他費用等，進行分析，比較各項投資費用占投資總額的百分數，以便找出采取降低投資費用的相應措施。

8.4.3 技術經濟效果綜合分析

技術經濟效果綜合分析的目的，在于完成年產量的前提下，選出一個投資省、周期短、見效快的最佳設計方案。上述經濟分析，僅僅是投資費用和產品成本這兩個指標的綜合分析。實際上還有一些經濟指標，比如投資回收期、投資利潤率、成本利潤率、年銷售收益比率、內部收益率等指標，用以評價設計方案的經濟效果和反映設計技術水平。

9.1 概述

生物反應器是指一個能為生物反應提供適宜的反應條件，以實現將原料轉化為特定產品的設備，是生物技術產業化的核心。

生物反應器設計的主要內容包括：（1）反應器選型，即根據生產工藝要求、反應及物料的特性等因素，確定反應器的操作方式、結構類型、傳遞和流動方式等；（2）設計反應器結構，確定各種結構參數，即確定反應器的內部結構及幾何尺寸、攪拌器形式、大小及轉速、換熱方式及換熱面積等；（3）確定工藝參數及其控制方式，如溫度、壓力、pH、通氣量、底物濃度、進料的濃度、流量和溫度等。

生物反應器設計的基本要求：

（1） 避免將必須蒸汽滅菌的部件與其它部件直接相連；

（2） 法蘭應盡量少；

（3） 盡可能采用焊接連接，焊接部位要充分拋光；

（4） 避免產生凹陷和裂縫；

（5） 設備各部件能分別進行滅菌；

（6） 反應器的接口處用蒸汽封口；

（7） 閥門要易清洗，易使用，易滅菌；

（8） 反應器內易保持一定正壓；

（9） 為便于清洗，反應器主體部分應盡量簡單。

反應器的設計以及工程放大，主要采用數學模型法，即利用數學模型來分析、研究生化反應過程中的現象和規律，即用數學語言表達過程中各種變量之間的關系。

數學模型的建立：以生物反應器為研究對象，將其中的生化反應過程分解為生化反應、傳遞過程及流體流動與混合等子過程，并分別進行研究，通過物料衡算和熱量衡算將各子過程的相關參數進行關聯和偶合，即對動力學方程、物料衡算及熱量衡算式聯立求解，從而得到所研究的生化反應過程規律的解析表達形式。

另一方面，由于生化反應過程極為復雜，往往對過程的機理研究得不透徹或有些問題尚不清楚，在這種情況下，就必須結合一定的經驗模型，即在一定條件下由實驗數據進行數學關聯并擬合而得到的模型。

9.2反應器的分類和結構特點

由于生物催化劑種類和生產目的的多樣性，生物反應器種類繁多。不同的生物反應器在結構和操作方式上具有不同的特點。根據生物反應器的結構和操作方式的某些特征，可以從不同角度對其進行分類。

9.2.1根據反應器的操作方式分類

根據反應器的操作方式不同，可將生物反應器分為間歇式生物反應器、連續式生物反應器和半連續式（流加）生物反應器。

間歇式反應器，其基本特征是：反應物料一次性加入、一次性卸出，反應器內物系的組成僅隨時間而變化，屬于一種非穩態過程。間歇式反應器適用于多品種、小批量、反應速率較慢的反應過程，可以經常進行滅菌操作。在實際應用中，由于間歇培養不會產生嚴重的染菌問題、因周期短而較適合于遺傳變異性大的細胞、對過程控制的要求較低、能適應培養細胞株和產物經常變化的需要，因此是應用最廣泛的操作模式。

采用連續操作的反應器被稱為連續式反應器，這一操作方式的特點是原料連續流入反應器，反應產物則連續從反應器流出。反應器內任何部位的物系組成均不隨時間變化，故屬于穩態操作。連續操作反應器一般具有產品質量穩定、生產效率高等優點，因而適合于大批量生產。

半間歇半連續操作系指原料與產物只有其中一種為連續輸入或輸出，而其余則為分批加入或輸出的操作，相應的反應器稱為半連續式反應器或流加式反應器。半連續操作同時兼有間歇操作和連續操作某些特點的操作。

9.2.2根據催化劑分類

生物催化劑包括酶和細胞兩大類，相應地，生物反應器也可以分為酶反應器和細胞反應器。

酶催化反應與一般的化學反應并無本質的區別，催化劑本身不會因為反應而增加，但是酶催化反應的條件更加溫和。酶催化反應器的結構往往與化學反應器類似，且通常不需要太高的溫度和壓力。游離酶催化常采用攪拌罐反應器，固定化酶催化除了攪拌罐反應器外，常選擇固定床反應器，近年來，酶膜反應器的應用正在日益增多。

細胞培養過程是典型的自催化過程，細胞本身既是催化劑，同時又是反應的主要產物之一。因此，催化劑的量是隨反應的進行而不斷增大的。對于這種活的催化劑，在反應過程中保持細胞的生長和代謝活性是對反應器設計的最基本要求。

根據細胞類型的不同，細胞反應器又可分為微生物細胞反應器（通常稱為發酵罐）、動物細胞反應器和植物細胞反應器。根據不同類型細胞的生理特點，對反應器也有不同的要求。例如，動植物細胞是好氧的，同時對剪切力又非常敏感，在設計反應器時如何在氧傳遞和剪切力之間的矛盾找到一個平衡點就成為要考慮的首要問題；植物細胞培養可能需要可見光，就要采用光生物反應器。

9.2.3根據流體流動或混合狀況分類

對于連續反應器，有兩種理想的流動模型：一種是反應器內的流體在各個方向完全混合均勻，稱為全混流（CSTR），其主要特征是反應物加入到反應器中，同時反應產物也離開反應器，并保持反應體積不變，其過程是一物系中組成不隨時間改變的定態過程；

另一種則是通過反應器的所有物料以相同的方向、速度向前推進，在流體流動方向上完全不混合，而在垂直于流動方向的截面上則完全混合，所有微元體在反應器中所停留的時間都是相同的，這種流動模型稱為平推流、活塞流或柱塞流（PFR）。

實際反應器內流體的流動方式則往往介于上述兩種理想流動模型之間，稱為非理想流動（混合）模型。非理想生物反應器需要考慮流動和混合的非理想性，如：流體在連續操作反應器中的停留時間分布、微混合問題、反應器軸向或徑向擴（彌）散及反應器操作的震蕩問題等。間歇操作的非理想生物反應器則需要考慮混合時間、剪切力分布、各組分濃度及溫度分布等復雜問題。

9.2.4根據反應器結構特征及動力輸入方式分類

根據反應器的主要結構特征（如外形和內部結構）的不同，可以將其分為釜（罐）式、管式、塔式、膜式反應器等，它們之間的差別主要反映在其外形（長徑比）和內部結構上的不同。釜式生物反應器能用于間歇、流加和連續所有三種操作模式，而管式、塔式和生物膜反應器等則一般適用于連續操作的細胞反應工程。

根據動力輸入方式的不同，生物反應器可以分為機械攪拌反應器、氣流攪拌反應器和液體環流反應器。機械攪拌反應器采用機械攪拌實現反應體系的混合（圖9-1）。氣流攪拌反應器以壓縮空氣作為動力來源（圖9-2）。而液體環流反應器則通過外部的液體循環泵實現動力輸入（圖9-3）。

圖9-1機械攪拌反應器

（G — 氣體；L — 液體；M — 電機）

圖9-2氣流攪拌反應器

（G — 氣體；L — 液體）

圖9-3液體環流反應器

9.3 發酵罐設計與分析

9.3.1 通氣攪拌罐的結構特征

通氣攪拌罐是好氧生物反應器的典型代表，其主要組成部分有殼體、控溫部分、攪拌部分、通氣部分、進出料口、測量系統和附屬系統等。

反應器主體采用不銹鋼材料，通常采用渦輪式攪拌器。攪拌軸與罐體的連接要進行無菌密封。罐體底部設有空氣分布器或噴嘴，通過空氣過濾器的無菌空氣從孔徑幾毫米的多孔管鼓入培養液內。攪拌器由置于罐頂的攪拌電機以一定的轉速驅動旋轉，通過攪拌渦輪產生的液體漩渦及剪切力，將鼓入的空氣打碎成小氣泡，并均勻分散在培養液中。這樣，既提供了細胞生長所需氧，同時又使培養液濃度均勻。反應器的裝料系數一般為70～80％。系統通常還設有消泡裝置、參數測試元件、蛇管或夾套冷卻裝置等。典型通氣攪拌罐的一些基本特征可以參考圖9-4。

圖9-4 通氣攪拌罐的典型結構及尺寸

通氣攪拌罐適用于大多數的生物工程，它具有以下優點：pH值及溫度易于控制；工業放大方法研究比較多；適合連續培養。不足之處是：攪拌消耗的功率較大；結構比較復雜，難以徹底拆卸清洗，易染菌；剪切力稍大，特別是培養絲狀菌體時，對細胞有較大損傷，等等。

經過半個多世紀的發展，現在通氣攪拌罐的幾何尺寸都趨向于標準化，表9.1列舉了通氣攪拌罐一些主要相對尺寸的范圍。

表9-1通氣攪拌罐的一些主要相對尺寸的范圍

相對尺寸 符號 范圍 典型值

罐體的高徑比 H/D 1～3

攪拌槳直徑與罐體直徑之比 Di/D 1/3～1/2 1/3(Rushton槳)

擋板寬度與罐體直徑之比 Wb/D 1/8～1/12（4塊擋板） 1/10

最下層攪拌槳高度與罐體直徑之比 0.8～1.0

相鄰兩層攪拌槳距離與攪拌槳直徑之比 1～2.5

9.3.2 機械攪拌系統

作為通氣攪拌罐的主要特征之一，機械攪拌系統提供的動力是機械攪拌罐質量傳遞、熱量傳遞、混合和懸浮物均勻分布的基本保證。攪拌裝置的設計和選擇必須綜合考慮以滿足上述要求并降低造價和動力消耗。

機械攪拌系統由電機、變速箱、攪拌軸、攪拌槳、軸封和擋板組成。下面做簡要的介紹。

1．電機和變速箱

電機和變速箱置于罐體之外。對小型反應器，可以采用單相電驅動的電機，而大型反應器所用的一般均為三相電機。對大型反應器，由于電機的轉速一般遠高于攪拌轉速，必須通過變速箱降低轉速。實驗室小型反應器可以采用無級變速，不需要變速箱。在間歇培養時，細胞生長各個階段對剪切力和氧傳遞有不同的要求，為了降低功耗，最好采用可調速電機。

2．攪拌軸

攪拌軸既可以從頂部伸入罐體，也可以從底部伸入罐體，前者稱為上攪拌，后者稱為下攪拌。一般而言，上攪拌的制造和安裝成本要略高于下攪拌。但是，采用下攪拌時，培養基中的固體顆粒或者可溶性成分在水分揮發后形成的結晶會損壞軸封，使其維護成本增加。不同尺寸的通氣攪拌罐，其攪拌槳層數也不同，小型通氣攪拌罐一般只有一層攪拌槳，而大型通氣攪拌罐一般具有2～4層攪拌槳以改善混合和傳質。

3．軸封

軸封的主要作用是防止環境中的微生物侵入反應器以及培養液等發生泄漏。機械傳動部件往往是造成染菌的主要原因之一，因此軸封設計的關鍵是避免染菌和泄漏，應盡可能采用無菌密封材料。

4．擋板

為防止攪拌時液面上產生大的旋渦，并促進罐內流體在各個方向的混合，與攪拌槳相對應，在罐體上還安裝有擋板。擋板的設計要滿足“全擋板條件”。所謂全擋板條件，是指在攪拌罐中再增加擋板或其它附件時，攪拌功率不再增加。擋板的數目通常為4～6塊，其寬度為0.1～0.12D。全擋板條件是達到消除液面漩渦的最低條件。在一定的轉速下面增加罐內附件而軸功率保持不變。此條件與擋板數Z，擋板寬度W和罐徑D有關，必須滿足下面的關系式

（9-1）

式中 W—— 擋板寬度， m；

D—— 罐內徑， m；

Z—— 擋板數。

5．攪拌槳

根據攪拌所產生的流體運動的初始方向，可以將攪拌槳分為徑向流攪拌槳和軸向流攪拌槳（圖9-5）。徑向流攪拌槳將流體向外推進，遇反應器內壁和檔板后再向上下兩側折返，產生次生流（圖9-6a）。軸向流攪拌槳則使流體一開始就沿軸向運動（圖9-6b）。一般而言，帶軸向流攪拌槳的反應器，其功率準數較低，達到同樣混合效果所需消耗的能量要遠低于徑向流攪拌槳。徑向流攪拌槳所造成的剪切力大于軸向流攪拌槳，這有利于打碎氣泡，從而增大總括氧傳遞速率常數，但會對有些細胞產生傷害。因此，徑向流攪拌槳多用于對剪切力不敏感的好氧細菌和酵母的培養，而軸向流攪拌槳多用于對剪切力敏感的生物反應體系。對于大型發酵罐，可采用這兩類攪拌槳混合配置的設計，以充分發揮各自的優點。最下層的槳一般采用平板槳，這種槳具有優良的氣泡破碎效果，這是在青霉素發酵研究和開發中得到的經驗，一直沿用至今。

六直葉圓盤渦輪攪拌器(Rushton槳) 六彎葉圓盤渦輪攪拌器 三葉后掠式攪拌器

徑向流攪拌漿

推進式攪拌器 四折葉開啟渦輪攪拌器 六折葉圓盤渦輪攪拌器

軸向流攪拌漿

圖9-5 徑向流攪拌槳和軸向流攪拌槳示例

a軸向流 b徑向流

圖9-6 軸向流和徑向流示意圖

9.3.3 反應器的攪拌功率

攪拌功率的大小對流體的混合、氣液固三相間的質量傳遞一級反應器的熱量傳遞都有很多的影響。因此，生物反應器攪拌功率的確定對于反應器的設計是相當重要的。

1．不通氣條件下的攪拌功率計算

在機械攪拌發酵罐中，攪拌器的輸出功率P0(W)與下列因素有關：發酵罐直徑D（m）、攪拌器直徑d（m）、液面高度HL（m）、攪拌器的轉速N（r/s）、液體黏度μ（Pa?s）、流體密度ρ(kg/m3)、重力加速度g（m/s2）以及攪拌器形式和結構等。通過量綱分析及實驗證實，對于牛頓型流體而言，可以得到下列準數關聯式：

（9-2）

式中

——功率準數；

——攪拌情況下的雷諾數；

——攪拌下的弗魯特數；

K——與攪拌器類型、發酵罐幾何尺寸有關的常數。

從而上式又可改寫為

（9-3）

實驗證實，在全擋板條件下，液面未出現漩渦，此時指數y＝0，上式可簡化為 ，即攪拌準數Np式攪拌雷諾數ReM的函數。

2．通氣條件下的攪拌功率計算

當發酵罐通入壓縮空氣后，攪拌器的軸功率與不通氣時相比會有所下降，減小的程度與通氣量相關。可能的原因有：通氣使得液體密度下降；通氣使得液體發生翻動。為了計算通氣條件下的攪拌功率，必須引入通氣準數Na，它表示發酵罐內空氣的表觀流速與攪拌葉頂端流速之比，即

（9-4）

式中

Qg —— 工況通氣量，m3/s；

d —— 攪拌槳直徑，m；

N —— 攪拌轉速，r/s

用Pg表示通氣條件下的攪拌功率，P0為不通氣時的攪拌功率，則

當Na ＜0.035時， （9-5）

當Na ≥0.035時， （9-6）

3．非牛頓流體特性對攪拌功率計算的影響

通常將不服從牛頓黏性定律的流體稱為非牛頓流體，非牛頓流體的剪應力與切變率不成正比關系，因而非牛頓流體沒有確定的粘度值。常見的非牛頓流體可分為三類。

① 擬塑性流體 其剪應力與剪切率的關系滿足

（9-7）

式中

k —— 均勻性系數，也稱稠度指數；

n —— 流動性指數，n＜1。

大多數發酵液都屬于這種類型。特點是隨著k增大，流體就越黏，n值越小，流體的非牛頓性越明顯。

② 彬漢塑性流體 其特點是剪應力與剪切率的關系是不通過原點的直線。

（9-8）

式中

—— 屈服剪應力；

—— 剛性系數

③ 漲塑性流體

（9-9）

式中

k —— 均勻性系數

n —— 流動性指數，n＞1。

對于非牛頓型流體攪拌功率的計算與牛頓型流體攪拌功率的計算方法一樣，可用 的關系式進行計算。但這類流體的黏度是隨攪拌速度甚至發酵時間而變化的，因而必須事先知道發酵液黏度與它們的關系，然后才能計算不同條件下的ReM。但從大量的實驗數據中可以看出，牛頓型流體和非牛頓型流體的Np－ReM曲線基本吻合，僅在ReM =10～300區間之內存在較大的差別，因此，在計算當中可直接按照牛頓型流體進行攪拌功率的計算。

9.3.4 通氣系統

通氣系統由無菌空氣制備系統、空氣分布裝置和出口氣體除菌系統組成。無菌空氣制備系統是一套相對獨立的復雜系統，這里不做介紹。

細胞生長和代謝所需的無菌空氣通過空氣分布管引入罐中。空氣分布管一般位于最下層的攪拌槳的正下方。為保證氣泡的分散，多采用帶小孔的環狀空氣分布管，環的直徑一般等于攪拌槳的直徑。在大型通氣攪拌罐中，攪拌槳尖附近的剪切力非常大，一般足以達到充分打碎氣泡的目的，為防止培養液中的固體物料或菌絲堵塞空氣分布管，對某些特殊的發酵體系有時采用向下開口的單孔管。

在一些簡單的反應器中，氣體的排出只是通過一個簡單的閥門控制的。為避免染菌，必須調節空氣的排出閥以保證反應器內始終處于高于大氣壓的正壓狀態。一些精密的反應器則配備了出口氣體冷凝裝置和過濾裝置

9.3.5 溫度控制系統

為了保證為細胞生長和代謝提供合適的溫度，溫度控制系統也是通氣攪拌罐所必備的。溫度控制系統由溫度測量電極、熱交換裝置及相應的控制裝置組成。

由于生物反應和機械攪拌都是放熱過程，多數生物反應體系在運行期間需要冷卻，就地滅菌后的培養基更要求快速泠卻。對大型通氣攪拌罐，通常采用罐內安裝的冷卻盤管或采用夾套式發酵罐進行溫度控制；而對5m3以下的小型通氣攪拌罐，熱交換器多采用夾套作為換熱裝置。對大型反應器，盤管的冷卻效率要遠高于夾套，而且傳熱面積可以根據需要設計，但它要占用反應器空間，并使反應器清洗和滅菌更加困難。為了強化傳熱，夾套可以設計成蜂窩狀以增加冷卻介質的流速，這樣可以彌補傳熱面積不足的限制。

培養基的就地滅菌需要加熱裝置。有時細胞培養的開始階段和結束階段由于細胞產生的代謝熱不足以維持生物反應器內的最適溫度，需要通過熱交換器加熱。大型反應器培養基的就地滅菌一般采用直接向反應器中通入高壓水蒸汽的方法實現快速加熱。小型反應器則通常采用夾套加熱或電加熱。

9.3.6 pH值和溶氧測量與控制系統

細胞生長都有最適pH值，因此需要對培養介質的pH進行檢測和控制。

pH控制系統包括pH電極、酸及堿儲罐、耐酸或堿的管道和泵及相應的控制系統組成。根據不同生物反應體系的實際需要，可以只加酸或加堿系統，也可以兩者都具備。在流加培養時，通過碳源或/和氮源的補料也能起到調節pH的作用。

溶氧是好氧發酵體系最重要的參數之一。傳統的工業發酵罐只是簡單地通過人工調節空氣流量來實現溶氧控制，可滅菌的溶氧電極改變了這種情況，使溶解氧濃度也可以實現在線檢測和控制，為及時了解發酵過程的進程及提高產物產量創造了條件。有些先進的發酵罐還配備了發酵罐尾氣分析裝置，可在線分析尾氣中的氧及二氧化碳濃度，以協助判斷發酵的過程的正常與否，對發酵動力學及代謝流分析等都很有幫助。有些發酵過程是微好氧過程，要求反應體系保持很低的溶氧值；還有一些高好氧過程的氧消耗速率很快，造成發酵液中的溶解氧濃度很低，這些過低的溶氧值都可能是溶氧電極無法精確測量的。這種情況就需要安裝氧化還原電極以檢測細胞培養的正常與否。

9.3.7 消泡系統

消泡系統對好氧發酵過程是非常重要的。通氣攪拌罐的裝液量一般不能超過容器容積的70～80％，一方面，這是由于通氣后液面會有所上升；更重要的原因是，預留部分空間可以避免泡沫馬上沖出罐體，為消除泡沫提供一段緩沖的時間。一般對越容易產生泡沫的體系，裝液量要越少。圖9-4中，通氣攪拌罐頂部有一個額外的攪拌槳，稱為消泡槳，其作用就是通過機械作用消除泡沫。在多數情況下，僅憑消泡槳還不足以及時破壞所有的泡沫，因此通常還須進一步采用添加化學消泡劑的方法消泡。

植物油、聚醚類非離子型表面活性劑都可以用于化學消泡，它們可以直接在配制在培養基中，也可以在發酵過程中根據需要加入，或者兩種策略同時使用。為了及時檢測泡沫是否達到預警高度，通常在反應器上方裝有液位電極，一旦泡沫達到相應的高度，就可以通過消泡控制裝置自動向反應器中流加消泡劑。

9.5 其他反應器

9.5.1鼓泡塔生物反應器

鼓泡塔生物反應器（Bubble tower bioreactor），又稱鼓泡柱生物反應器（Bubble column bioreactor），是最簡單的氣流攪拌生物反應器。鼓泡塔生物反應器的罐體為一個較高的柱形容器，氣體作為分散相由反應器底部的氣體分布器進入，以氣流的動力實現反應體系的混合（圖9-7）。

圖9-7鼓泡塔生物反應器

與機械攪拌式反應器相比，鼓泡塔生物反應器的主要優點是：反應器結構簡單，易于操作，操作成本低；內無轉動設備，能耗較低，反應器中的剪切力也較小；由于避免了軸封，對保持無菌條件有利。因此，鼓泡塔生物反應器比較適合于那些對剪切力敏感、而且容易染菌的細胞培養體系，如某些微生物發酵、動物細胞培養和植物細胞培養等。但是，由于鼓泡塔生物反應器缺乏控制流體運動的措施，其混合和氧傳遞效率較低，為達到一定的混合和氧傳遞效果，鼓泡塔生物反應器通常采用高于通氣攪拌罐的通氣量，且其高徑比也較大。多數鼓泡塔反應器的高徑比在8:1到20:1之間。較高的高徑比使鼓泡塔反應器具有較高的氣含率和較長的氣體停留時間，也使其底部的空氣分布裝置處具有較高的靜水壓，這些都在一定程度上有利于提高氧傳遞效率。目前，鼓泡塔反應器被廣泛應用于生物工程行業中，例如乙醇發酵、單細胞蛋白發酵、廢水處理、廢氣處理等。

9.5.2氣升式生物反應器

氣升式生物反應器（Airlift loop bioreactor）是應用最為廣泛的生物反應器之一。它是在鼓泡塔的基礎上發展起來的，它利用氣體的噴射功能和流體密度差造成反應液循環流動，并通過安裝導流筒（Draft tube）來增強反應器內的傳遞效果和強化流體的循環流動。

氣升式反應器的導流筒有多種類型，按其采取的液體循環方式不同可以將其分為內循環氣升式環流反應器（圖9-8a）和外循環氣升式環流反應器（圖9-8b）兩類。其中以內循環氣升式環流反應器最為常見，其優點是結構簡單、設備制造比較容易。氣體既可以從內置導流筒內部通入，也可以從其外側通入，兩種情況下上行區和下行區剛好相反（圖9-9）。反應器頂部是氣體脫離反應體系的區域，因而稱為脫離區。有些氣升式反應器頂部脫離區的直徑要大于主罐體的直徑，目的是降低該區域的流體運動速率，給氣泡脫離以充分的時間，避免或減少富含二氧化碳的氣泡通過下行區循環回反應器；另外，這也有助于減少因形成氣霧而損失培養基，并可減少泡沫的產生。

a. 內循環氣升式生物環流反應器 b.外循環氣升式生物環流反應器

圖9-8氣升式生物反應器（G為氣體分布器）

氣升式生物反應器的氣體分布裝置也可采用噴嘴（圖9-10）。為了提高氧傳遞效率，可利用噴嘴口及其附近高速運動的流體產生強剪切力來減小氣泡尺寸，該類反應器稱為氣升式噴射環流生物反應器。噴嘴的設計方式多種多樣，但其基本原理均一致，圖9-11給出了不同樣式的噴嘴設計形式。

氣升式生物反應器除具有鼓泡塔生物反應器的優點外，還具有反應溶液分布均勻、高的溶氧速率和溶氧效率、剪切應力小、傳熱良好等優點。同時，它要求的通氣量和通氣壓力較高，使空氣凈化工段的負荷增加，對于黏度較大的培養液，溶解氧系數較低。另外，操作彈性小，低氣速在高密度培養時，其混合效果較差。通氣量提高會導致泡沫產生。

圖9-9 上行區、下行區和脫離區

（G為氣體，L為液體，F表示流量）

圖9-10采用噴嘴的氣升式生物反應器

（G為氣體，F為循環流體）

圖9-11氣升式生物反應器的幾種噴嘴設計方案

影響氣升式生物反應器的主要結構和操作參數有：氣含率、氣液比、循環周期與循環速度、通氣功率等。

（1） 氣含率

氣含率是氣升式生物反應器的一個主要參數。在含有導流筒的內循環氣升式生物反應器中，氣含率定義為

平均體積氣含率 （9.12）

導流筒內（上升區域）氣含率 （9.13）

環隙內（下降區域）氣含率 （9.14）

局部氣含率 （9.15）

（2）循環周期與循環速度

循環周期指液體微元在反應器內循環一周所需要的平均時間，即平均循環時間。循環周期一般在2.5～4min之間。循環周期 可用下式進行計算：

（9.16）

式中

——循環周期，s；

——發酵液體積，m3；

——發酵液環流量，m3/s；

w ——發酵液在環流管內流速，m/s；

d ——環流罐內徑，m。

（3）氣液比

氣液比是指發酵液的環流量QC與通風量Q之比：

（9.17）

式中

Q——通風量，m3/s。

（4）通氣功率 PG

氣升式生物反應器的通氣功率可用下式進行計算：

（9.18）

式中

——發酵液密度，kg/m3；

g —— 重力加速度，m/s2；

H —— 氣體分布器距液面高度，m；

Q——通風量，m3/s。

一般來說，在相同條件下，通氣功率越大，供氧速率越大，供氧功率因數越小。

9.5.3固定床生物反應器

固定床生物反應器（Fixed bed bioreactor）是由連續流動的液體底物和靜止不動的固定化生物催化劑組成，另外，也可以由連續不動的氣體和靜止不動的固體底物和微生物組成。根據反應器中液相流動方式的差別，可以將常見的固定床生物反應器分為兩種：一為填充床生物反應器，一為涓流床生物反應器。

填充床生物反應器（Packed bed bioreactor）可以是垂直的，也可以是水平的（圖9-12）。垂直的填充床生物反應器比較常見，反應器中流體通常從底部進入反應器，從頂部流出，細胞固定于支持物表面或內部,支持物顆粒堆疊成床，培養基在床層間流動。填充床中單位體積細胞較多，由于混合效果不好常使床內氧的傳遞、氣體的派出、溫度和pH的控制困難；另外一個困難就是床層容易被小顆粒或以破碎的顆粒堵塞，流體流動困難，床層阻力增大。

圖9-12 填充床生物反應器

填充床生物反應器在固定化酶催化反應體系中比較常見，下面的討論中將忽略反應器軸向彌散的影響，液體流動方式假設可以用理想的平推流來描述。由于固定化反應器的一部分空間被生物催化劑的固體顆粒占據，在分析動力學行為前必須先引入空隙率的概念。空隙率ε定義為：

(9-19)

式中

VS —— 反應器中空隙體積，m3；

VT —— 反應器中固體的真實體積，m3；

VR —— 反應器總體積，m3。

若反應器總體積為V，長度為L，流體的流量為F，則反應器中液體的實際流速為：

(9-20)

由此可以求出流體在反應器中的停留時間τ，

(9-21)

在選擇固定化細胞反應器時，傳質是重要的考慮因素。填充床生物反應器的傳質狀況較差，一般只適合于固定化非生長細胞或厭氧的固定化生長細胞。對固定化非生長細胞，因為不需要供應氧，一般也不需要移去氣態CO2，操作相對比較方便。對厭氧的生長細胞，雖然不需要通空氣，但反應過程中必須及時地將代謝產生的CO2移出反應器，為此可以考慮采用水平放置的填充床，在反應器上方給發酵產生的CO2留出適當的空間，以便在不夾帶液體的情況下將氣體排出。

9.5.4流化床生物反應器

流化床生物反應器（Fluidized bed bioreactor）是通過流態化（Fluidization）來強化固體顆粒與流體相之間混合、傳質和傳熱的反應裝置。實現流態化的能量是輸入反應器的流體所攜帶的動能，這種流體既可以是液體，也可以是氣體，或者兩者皆是。

與固定床生物反應器相比，流化床生物反應器能提供更好的混合、傳質及傳熱效果和最小的反應器壓降。另外，流化床生物反應器還具有以下優點：

1） 由于流體混合更加均勻，反應器中的pH、溶氧、溫度等參數的檢測和控制更加容易；

2） 固相組成在軸向的差異性較小，便于取樣和分析；

3） 不易發生阻塞，因而可以采用尺寸更小、比表面積更大的固定化載體顆粒，從而為細胞的固定化提供更大的表面積。

從應用角度看，上述這些特性對反應器的可操作性是至關重要的。

在生物反應體系中，常見的流化床生物反應器為又可分為液—固兩相流化床生物反應器和氣—液—固三相流化床生物反應器（圖9-13），前者用于厭氧生物反應體系（由于厭氧發酵會回產生氣體，實際上也是一個三相體系），而后者多用于好氧過程。

圖9-13 流化床生物反應器

要使固體粒子處于流化狀態是需要消耗能量的，只有當流體流速大于最小流化速度時粒子才能流化。好在固定化細胞的載體材料（如海藻酸鈣、纖維等）密度較小，所要求的最小流化速度也比較小。流體的流速與反應過程的轉化率直接相關，達到流態化所需的流量往往要超過根據反應動力學和目標轉化率確定的操作流量。在這種情況下，為了同時保證合適的轉化率和達到流態化，對液—固兩相流化床生物反應器通常都利用外部的液體循環泵進行反應液的循環以期達到流態化所需的流量。對氣—液—固三相流化床生物反應器，是否需要采用額外的液體循環系統取決于過量的通氣是否會對細胞生長產生負面影響，以及通氣和液體循環之間的成本比較。

流化床的基本參數包括床層流化速度、顆粒的帶出速度、操作速度、流化數以及床層的膨脹比等，下面分別做一些介紹。

（1） 流化速度Umf

當流體流過顆粒床層的阻力等于床層顆粒重力時，床層中的顆粒就開始流動起來，此時的流體稱作床層的流化速度，記作Umf。它僅與流體和顆粒的物性有關。具有代表性的計算公式有：

對于 ＜20的小顆粒， (9-22)

對于 ＞1000的大顆粒，(9-23)

式中

dp —— 顆粒的平均粒徑，m；

、 ——氣體和顆粒的密度，kg/m3；

—— 氣體的黏度，Pa?s；

g —— 重力加速度，m/s2。

（2） 顆粒的帶出速度Ut

如果床內流體的速度等于顆粒在流體中的自由沉降速度時，顆粒開始從床內流出，此時流體的速度稱為顆粒的帶出速度，記做Ut。

當 ＜0.4時，(9-24)

當0.4＜ ＜500時，(9-25)

當 ＞500時，(9-26)

（3） 操作速度U0和流化數ω

操作速度U0即表示流化床在正常操作時流體的速度，一般Umf＜U0＜Ut。而流化數ω表示操作速度與起始流化速度之比，即ω＝U0 /Umf，對于一般的流化床，ω＝1.5～10，但對于有些流化床ω可以達到幾十甚至幾百。流化床操作速度U0大小選擇原則是：當過程為效應不大，反應速度慢，催化劑顆粒小，篩分寬，床內無內部構件和要求催化劑帶出量少的情況，宜采用較低的氣速，反之，則采用較高的氣速。

床層的膨脹比R為床層正常流化時床層高度Hf與床層處于其實流化態時的床層高度Hmf之比，即(9-27)

式中

ε、 ——床層的空隙率、密度；

下標mf、f——起始流化、正常流化狀態。

對于粗顆粒床（dp＞100 m），R≈1.1～1.2

對于細顆粒床（dp＜100 m），R≈1.2～1.7

流化床生物反應器的設計

（1） 床徑DT的確定

當生產能力，即單位時間內反應器的體積流量V給定后，根據工程特點選定流化數ω或操作速度U0，則床層的殼體直徑DT可以由下式給出： (9-28)

即 (9-29)

（2） 床層流化高度Hf的確定

正常流化床的床高 ,其中， 為床層起始流化床狀態時的床層高度，R為床層的膨脹比。

（3） 擴大段直徑D的確定

如果顆粒回收需要在床層上部加擴大段作為自由沉降段，則其直徑D由最大顆粒的帶出速度Ut決定，即 (9-30)

10.1 中試放大的概念與內容

10.1.1 中試放大的概念

由原料到成品之間的各個相互連接的單元操作過程及其質量監控是生產工藝過程，一個產品由若干個車間線完成生產。由具有直接關系的單元操作的次序、條件組成了工藝過程，輔助過程包括動力供應、原料供應、包裝、儲運、三廢處理等。將實驗室和中試車間試驗取得的研究結果應用到大規模的工業生產中的過程就是放大（Scale up）。工藝的放大包括實驗室、中試工廠（車間）和生產車間3個步驟。

制藥工藝過程的開發研究包括以下內容：

（1）實驗室小試：在實驗室規模的條件下進行，研究化學或生物合成反應步驟及其規律，考查工藝參數、設備與原料，轉化率，收率，成本估算等。目的是為中試做技術準備。要求收率穩定，質量可靠。確定操作條件，制成品、半成品、中間品、原料等建立相應的分析方法。

（2）中試放大：把實驗室小試研究確定的工藝路線與條件，放大50－100倍的中等規模，進行工藝試驗，工業化生產考查、優化，包括產品質量、經濟效益、勞動強度等，確定最佳操作條件。目的是為車間設計、施工安裝、中間質控，制定質量要求與規程提供數據和資料。

（3）制定生產工藝：在大型設備和車間投入生產，試制若干批號后，制定出生產工藝規程。

10.1.2 中試放大內容

中試放大的內容是研究在一定規模設備中的操作參數和條件的變化規律，驗證實驗室工藝路線的可行性，解決在實驗室階段未能解決或尚未發現的問題。

1、驗證工藝路線，修正工藝過程，確定生產工藝流程。

2、工藝條件限度實驗與過程優化控制。

3、原輔料和中間體質量控制。

10.2 中試放大研究的基本方法

10.2.1 經驗放大

經驗放大是根據已有的操作經驗，所建立的一些規律，通過摸索反應器的特征，從實驗室裝置到中試裝置、再到車間大型裝置，實現逐級放大。這些規律大多是半定性的，是簡單和粗放的定量。經驗放大是基于空時得率相等的原則，即雖然反應規模不同，但單位時間、單位體積反應器所生產的產品量(或處理的原料量)是相同的，通過物料平衡，求出為完成規定的生產任務所需處理的原料量后，得到空時得串的經驗數據，即可求得放大反應所需反應器的容積。經驗放大的原則有：

1、幾何相似放大。按反應器各部件的幾何尺寸比例進行放大，放大倍數是實際反應器體積的倍數。當體積放大10倍時，反應器的高度和直徑均放大 倍。

2、恒定等體積攪拌功率放大，是一般化學反應器的放大準則。

3、恒定體積氧傳質系數放大。

4、恒定空氣線速度放大。

5、恒定體積的空氣流量放大。

6、恒定攪拌器葉尖速度放大。

7、恒定混合時間放大。

采用經驗放大法的前提條件是放大的反應裝置必須與提供經驗數據的裝置保持完全相同的操作條件。經驗放大法適用于反應器的攪拌形式、結構等反應條件相似的情況，而且放大倍數不宜過大。由于化學合成藥物生產中化學反應復雜，原料與中間體種類繁多，化學動力學方面的研究往往又不夠充分，因此難于從理論上精確地對反應器進行計算。反應器的放大問題還沒有解決，主要采用經驗放大。據統計，實際放大過程中應用最多的是體積氧傳質系數相同的放大。

10.2.2 相似模擬放大

根據相似理論，保持無因次準數（相似準數）相等的原則進行放大。基于對過程的了解，確定影響因素，用因次分析求得相似準數，根據相似理論的第一定律，系統相似時同一相似準數的數值相同，計算后，進行放大。已成功應用于各種物理過程，但化學反應過程和生化反應有一定困難。在反應器中，反應與流體流動、傳熱及傳質過程交織在一起，要同時保持幾何相似、流體力學相似、傳熱相似、傳質相似相反應相似是不可能的。

10.2.3 數學模擬放大

數學模擬放大是用數學方程式表述實際過程和實驗結果，然后計算機模擬研究、設計，放大。建立數學模型的方法有導師型、無導師型和混合型。影響反應的因素復雜，不可能用數學方程全面、定量描述過程的真實情況。一般地，先對過程進行合理簡化，提出物理模型，模擬實際過程。再對物理模型進行數學描述，從而得到數學模型。對數學模型，在計算機上研究各參數的變化對過程的影響。數學模擬放大法以過程參數間的定量關系為基礎，能進行高倍數放大，縮短放大周期。

數學模擬進行工程放大，主要取決于預測大設備的行為的數學模型的可靠性。比較分析模型計算結果與中試放大或生產設備的數據，對模型進行修正，可提高數學模型的可靠性。精確的模擬需要大量的基礎研究工作，過程參數的定量關系等，因此在實際應用有效的事例并不多見，但代表著放大的發展方向。

10.3 中試放大的研究

10.3.1 原料的特點

生物材料本身成分復雜，除多糖、蛋白質、核酸、脂類等高分子化合物外，還有糖蛋白等復合物。生物技術藥物的含量較低，存在異構體等。對于基因工程技術生產的蛋白質藥物，其活性與結構和構象有密切關系。空間構象的破壞往往導致藥物失活。維持空間結構的次級鍵對酸、堿、有機試劑、重金屬、熱、光等因素敏感。所處的環境和介質影響其結構，生產中的機械剪切力、金屬器壁的摩擦力、傳熱傳質等過程不僅會影響細胞的活性與功能，也影響藥物的活性。生產條件的變化對質量影響大，在工藝放大過程中應嚴格監測質量的動態變化，在分離純化等過程必須采用措施防止變性失活。生物技術藥物具有低穩定性，易受物理化學和生物因素的影響而變性失去活性。細胞破碎后，打破了原有的亞細胞布局，不再存在細胞隔室，藥物失去了空間保護。一旦提取出來后，離體的藥物，容易受到理化因素的攻擊，變性失去活性。與化學藥物不同，生物技術藥物生產過程可能產生熱源（pyrogen）和過敏原(allergen)。

10.3.2 中試放大的裝置

中試放大采用的裝置，根據反應類型、操作條件等選擇和設計，要考慮對材質和型式的要求，特別是接觸腐蝕性物料，并按照工藝流程進行安裝。可用微型中間裝置取代大型中間裝置，為工業化裝置提供精確的設計數據。在一般情況下，不必全工藝流程的中試放大，以關鍵環節就可以中試放大。中試放大也可以在適應性很強的多功能車間中進行，無需按生產流程來布置生產設備，對樣品制備或進行小批量試制，適合多種產品的中試放大。

制藥是在反應器內進行的，無論離體還是在體反應器，各類設備都是進行現代制藥工藝、實現最終產品必不可缺的硬件。對于藥物生產領域，不同的生物來源的藥物，其原料（即生物細胞）的培養、處理和藥物的制造過程都有較大的區別。要求設備是智能化、全自動化、密閉、在線實時檢測，盡可能減少人為操作因素，保證質量的穩定、可控，生產高效率。生物技術制藥的規模，一方面追求提高反應器體積，目前攪拌罐反應器的體積已達到500M3，而單細胞蛋白反應器達2000M3。另一方面，如單克隆抗體等免疫與診斷試劑，卻在實驗室規模生產制造就能滿足需要。在某些藥物的制造中，反應器成為其大規模生產的限制因素。

10.3.3 操作方法

在中試放大階段，根據物料的處理量和類型，應考慮反應與后處理的操作方法與工業化規模相適應，縮短工序，簡化操作。減輕勞動強度，盡可能自動化操作和輸送，良好的安全工作環境和工作條件。

藥物的結構和組成決定著其性質，各種理化和生物條件均能影響其活性，綜合考慮這些因素以及工程因素，合理設計生產工藝路線，研制高效表達的載體及宿主系統，研制生物反應器并優化培養條件，研制經濟適用的高效分離純化方法及設備，自動化監控質量過程等，對細胞進行大規模培養，從而制造目標藥物。

10.3.4 生產工藝規程

產品介紹：名稱（商品名、化學名、英文名），化學結構、分子式、分子量，規格，理化性質，質量標準及檢驗方法，藥理作用，毒副作用，用途、適應癥和用法、包裝和貯存。

反應過程：主反應、副反應、輔助反應，終點控制。

生產工藝流程：以反應為中心，圖解物理化學過程。

設備表：崗位，名稱，規格，數量，體積和性能，材質，動力。

設備使用：使用方法和注意事項。

原輔料和中間體及其質量標準：規格，名稱（商品名、化學名、英文名），化學結構、分子式、分子量，理化性質，質量標準及檢驗方法，注意事項。

生產工藝過程：反應介質，工藝操作，工藝條件和注意事項，終點控制，異常現象及其處理。

操作工時與生產周期：崗位與工序，操作時間，生產時間，輔助操作時間，生產總周期。

生產經濟指標：生產能力，成品和副產品，收率；生產率和成本；原輔料等消耗。

技術安全：易燃、易爆、有毒物料及其容器操作的防火、防爆的預防原則與技術措施，注意事項。